Summary

Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

Published: September 19, 2018
doi:

Summary

Capillaire elektrisch gericht is een antilichaam gebaseerde, ultrasensitive, hoge doorvoer techniek, waardoor gedetailleerde karakterisering van eiwitten en hun isoforms van extreem kleine biologische monsters. Het volgende beschrijft een protocol voor de detectie en kwantificering van specifieke proteïnen en hun isoforms in een geautomatiseerd en gerobotiseerd wijze.

Abstract

Immunoblotting is uitgegroeid tot een routine techniek in veel laboratoria voor eiwit karakterisering van biologische monsters. Het volgende protocol biedt een alternatieve strategie, capillaire elektrisch scherpstellen (cIEF), met vele voordelen ten opzichte van conventionele immunoblotting. Dit is een methode van het antilichaam gebaseerde, geautomatiseerde, snelle en kwantitatieve waarin een volledige westelijke bevlekkende procedure binnen een uiterst dunne capillair plaatsvindt. Deze techniek niet vereisen een gel overbrengen naar een membraan, strippen van vlekken, of x-ray films, die doorgaans vereist voor conventionele immunoblotting zijn. Hier, de eiwitten worden gescheiden volgens hun lading (elektrisch punt, pI), met behulp van minder dan een microliter (400 nL) totaal eiwit lysate. Na elektroforese, eiwitten zijn geïmmobiliseerd op de capillaire wanden door ultraviolet licht behandeling, gevolgd door de primaire en secundaire (horseradish peroxidase (HRP) geconjugeerd) antilichaam-incubatie, waarvan de afhankelijkheid wordt gedetecteerd door middel van verbeterde Chemoluminescentie (ECL), het genereren van een licht signaal dat kan worden gevangen en opgenomen door een camera van de charge – coupled apparaat (CCD). Het digitale beeld kan worden geanalyseerd en gekwantificeerd (piekoppervlakte) met behulp van software. Deze hoge doorvoer procedure aankan 96 monsters tegelijk; is hoogst-gevoelig, met de detectie van de eiwitten in het picogram bereik; en produceert zeer reproduceerbare resultaten vanwege automatisering. Al deze aspecten zijn uiterst waardevol wanneer de hoeveelheid van monsters (b.v., weefselsteekproeven en biopten) een beperkende factor is. De techniek heeft bredere toepassingen, met inbegrip van screening van drugs of antilichamen, ontdekking van biomarker en diagnostische doeleinden.

Introduction

Capillaire elektrisch scherpstelling (cIEF) is een geautomatiseerde, capillair gebaseerde immunoassay dat eiwitten op basis van hun lading1,2,3 verhelpt. Het is zeer reproduceerbaar en staat te oplossen van eiwitten en hun post-translationally gemodificeerde isoforms snel en kwantitatief. Het presenteert een alternatief voor conventionele methoden zoals het westelijke bevlekken. Terwijl het westelijke bevlekken is heel goed voor de bevestiging van de aanwezigheid van overvloedig eiwitten in gemakkelijk toegankelijke monsters; variabiliteit, tijd consumptie en nauwkeurige kwantificatie allemaal aanwezig uitdagingen, met name bij de behandeling van biologisch weefselmonsters. Inderdaad, variabiliteit is een inherent probleem in het westelijke bevlekken, want er zijn talrijke stappen betrokken, zoals laden en uitvoeren van SDS-pagina gelen, overdracht van eiwitten op membraan, incubatie met verschillende reagentia (bv. primaire en secundaire antistoffen, ECL), en de ontwikkeling op een X-ray film4. Op dit moment is de westelijke bevlekkende techniek verbeteren met de implementatie van digitale opname van chemiluminescentie signalen (digitale westerns). Onlangs, een geautomatiseerd westelijke bevlekkende systeem heeft ontwikkeld, namelijk het capillair westerse, dat is een meer handsfree en gel-vrij systeem. De gehele test is geautomatiseerd na het laden van een monster plaat (monsters met alle nodige reagentia) in het systeem3,4. Het instrument zal het uitvoeren van alle stappen zoals eiwit scheiding, immobilisatie van eiwitten op capillaire wand, antilichaam incubations, wast tussen verschillende stappen, en de ontwikkeling en de kwantificering van de chemiluminescentie signalen. De procedure van de cIEF hier gepresenteerd biedt dus een hogere resolutie en gevoeligheid.

Deze methode is gevoelig, zoals signalen kunnen worden gegenereerd en gekwantificeerd van picogram van eiwitten1. De hoge gevoeligheid met uitstekende reproduceerbaarheid maakt deze technologie zeer nuttig zijn voor de analyse van klinische monsters. Het kan detecteren evenals onderscheiden post translationeel wijziging (bijvoorbeeld verschillende gefosforyleerd eiwit isoforms) van eiwitten. Deze technologie is met succes gebruikt om te ontleden van verschillende signalering trajecten4,5 in klinische studies gericht op de ontwikkeling van nieuwe therapieën in kanker3, en het heeft een groot potentieel voor eiwit biomerker en drug discovery .

Protocol

1. cultuur, stimulatie en Lysis van de cel Opmerking: Deze methode kan worden gebruikt met vele celtypes. Ter illustratie van de methode, wordt een voorbeeld van het gebruik van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs) beschreven. HUVECs op 10 cm petrischalen gelatine-bekleed, in de basale medium endothelial cel met passende suppletie cultuur (Zie Tabel of Materials), en ook met 5% FCS, epidermale groeifactor (5 ng/mL), vasculaire endotheliale groeifa…

Representative Results

Ontwerp van een nieuwe test: Een plaat van assay lay-out wordt weergegeven in figuur 1A. 96-wells, kunnen maximaal, voor elke voorwaarde (antilichamen) van de plaat 384-well in blokken van 12 putjes te worden gebruikt. Elk blok met 12 putjes kunt starten vanuit A1-A12 of A13-A24. Kleurcode rijen kunnen men onderscheiden van monsters of reagentia van elkaar. De assay sjabloon (figuur 1B), relevante informatie voor…

Discussion

Gevoeligheid en resolutie van eiwitten zijn cruciaal voor proteoom onderzoek naar biologische monsters. Er is grote waarde zijnde kundig voor detecteren van eiwitten die in minieme hoeveelheden in cellen aanwezig zijn. cIEF bieden verbeterde gevoeligheid en resolutie voor de detectie van eiwitten en hun isoforms4.

Deze technologie is met succes gebruikt in vele Proteoom Onderzoek rapporten5,6,<sup cla…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteur dankt Prof. Lena Claesson-Welsh, de Universiteit van Uppsala, Zweden voor haar steun voor de ontwikkeling van dit project. Bovendien, dankzij de auteur Ross Smith en Lena Claesson-Welsh, de Universiteit van Uppsala voor hun kritische lezing en suggesties ter verbetering van het manuscript.

Materials

NanoPro 1000 ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug ProteinSimple 040-972 Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix ProteinSimple 040-510 Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor Mix ProteinSimple 040-482 Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3 ProteinSimple 040-646 For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluent ProteinSimple 040-649
Antibody diluent  ProteinSimple 040-309
Wash concentrate ProteinSimple 041-108
Anolyte Refill ProteinSimple 040-337
Catholyte Refill ProteinSimple 040-338
Peroxide XDR ProteinSimple 041-084
Luminol ProteinSimple 040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer ProteinSimple 040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for  ProteinSimple CBS700
Assay Plate/Lid Kit ProteinSimple 040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch  711-035-152 For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch  715-035-150 For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody Cell Signaling 9101 For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody Cell Signaling 9102 For cIEF used (1: 100)
Compass software ProteinSimple
HUVEC ATCC PCS-100-010
MV2 (EBM-2) PromoCell  C-22221 Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack PromoCell C-39221 Supplementation to MV2 above
VEGFA PeproTech 100-20
Long R3 IGF Sigma-Aldrich 85580C/I1146 Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator) Diagenode B01020001
BCA Protein Assay kit  Thermo Fischer Scientific 23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fischer Scientific NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) Thermo Fischer Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X) Thermo Fischer Scientific NP0006
Immobilon PVDF membrane Millipore IPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors 
Tips
Ice

Referências

  1. O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
  2. Aspinall-O’Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
  3. Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
  4. Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
  5. Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
  6. Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
  7. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
  8. Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
  9. Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
  10. Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).

Play Video

Citar este artigo
Padhan, N. Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method. J. Vis. Exp. (139), e56794, doi:10.3791/56794 (2018).

View Video