タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出
Summary
キャピラリー等電集中はタンパク質と非常に小さい試料からアイソ フォームの詳細な特性解析を有効に、抗体を用いた、超高感度、高スループット手法です。次に、自動化・ ロボット化の方法で特定の蛋白質とアイソ フォームの検出と定量のためのプロトコルについて説明します。
Abstract
免疫ブロット生体試料中のタンパク質の特徴の多くの実験室のルーチンの技術となっています。次のプロトコルは、代替戦略を提供、従来免疫ブロット キャピラリー等電の多くの利点 (代表取締役) を中心に比べています。完全な西部のしみが付くプロシージャが起こる超毛細血管内抗体ベース、自動化、迅速かつ定量的な方法です。この手法、しみの除去、膜に転送するゲルを必要としないか、または x 線フィルム、通常従来免疫ブロットを必要です。充満 (等電点; pI) によるを使用してより小さい、1 マイクロリットルの蛋白質の分離、ここ (400 nL) 総蛋白ライセートの。電気泳動後のタンパク質はプライマリとセカンダリ (西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 共役) 続いて、紫外光照射による毛細血管壁に固定化抗体の孵化、バインドは検出が強化されました。化学発光 (ECL)、キャプチャおよび電荷結合素子 (CCD) カメラによって記録が可能な光信号を生成します。デジタル画像分析することができ、定量化 (ピーク面積) ソフトウェアを使用しています。この高スループット プロシージャは、同時に 96 のサンプルを処理できます。非常に敏感な picogram の範囲でタンパク質検出自動化のため再現性の高い結果を生成します。すべてのこれらの側面は、試料 (例えば、ティッシュ サンプルおよび生検) の数量が制限要因非常に貴重です。技術がより広いアプリケーションだけでなく、薬や抗体、バイオ マーカーの探索と診断のためのスクリーニングを含みます。
Introduction
その電荷1,2,3蛋白を解決する自動、キャピラリーを用いたイムノアッセイ法であるキャピラリー等電集中 (代表取締役)それは高い再現性で迅速かつ定量的に蛋白質とそのファーストクリーニング変更を解決することができます。西部にしみが付くことなど従来の方法に代わるものを提示します。西部にしみが付くことは非常に容易にアクセスできるサンプルの豊富な蛋白質の存在を確認するため良い変動、時間消費、および正確な定量すべての存在の課題、特に生体組織サンプルを調べるとき。確かに、変動は西部にしみが付くことで本質的な問題があると多数手順、読み込みと SDS ページのゲルの実行、膜への蛋白の転送など様々 な試薬と孵化 (e.g、プライマリおよびセカンダリ。ECL 抗体)、x 線フィルム4を開発。現在、西部のしみが付く技術は化学発光信号 (デジタル西部劇) のデジタル録音の実装を改善します。、自動化された西部しみが付くシステムは近年、すなわち毛細血管西部、よりハンズフリーし、ゲル無料システムであります。全体アッセイ システム3,4に次のサンプル プレート (すべての必要な試薬とサンプル) の読み込みを自動化されています。楽器は蛋白質の分離などのすべての手順を実行、抗体の孵化、毛細血管壁へのタンパク質固定化を別の手順と開発化学発光シグナルの定量化と洗います。したがって、ここに示す代表取締役手順は、高い解像度と感度を提供します。
この方法は、機密性の高い信号を生成され、蛋白質1の用いたから定量化することができます。優れた再現性と高感度はこの技術を臨床サンプルの解析に非常に便利になります。それは、検出、蛋白質のポスト並進変更 (例えば、異なるリン酸化タンパク質アイソ フォーム) を区別することができます。この技術は、正常に異なるシグナル伝達経路4,5がん3、新しい治療法を開発することを目指して臨床研究を分析する使用されています、蛋白質バイオ マーカーおよび薬剤の発見のための素晴らしい可能性を持っています。.
Protocol
Representative Results
Discussion
感度と分解能のタンパク質が生体試料のプロテオーム研究のため重要です。細胞内微量に含まれるタンパク質を検出できることに大きな価値があります。代表取締役には、感度の向上と蛋白質とのアイソ フォーム4の検出のための解像度を提供できます。
この技術は、多くプロテオーム研究レポート5,6,</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者教授レナ クラーソン-ウェールズ、ウプサラ大学、スウェーデンはこのプロジェクトを開発するための彼女のサポートのおかげでください。さらに、著者は、ロス スミスとレナ クラーソン-ウェールズ、ウプサラ大学の重要な読書と原稿を改善する提案をありがちましょう。
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
Referências
- O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O’Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
