Fabrikation procedurer for stærkt magnetisk lydhør lanthanide ion chelaterende polymolecular forsamlinger er præsenteret. Den magnetiske svar er dikteret af den forsamling størrelse, der er tilpasset ved ekstrudering gennem nanopore membraner. Forsamlinger magnetisk alignability og temperatur-inducerede strukturelle ændringer overvåges af dobbeltbrydning målinger, en gratis teknik til Kernemagnetisk resonans og small angle neutron scattering.
Bicelles er afstemmelige disk-lignende polymolecular forsamlinger dannet fra en lang række lipid blandinger. Applikationer spænder fra membran protein strukturelle undersøgelser af Kernemagnetisk resonans (NMR) til den nanoteknologiske udvikling herunder dannelsen af optisk aktiv og magnetisk switchable geler. Sådanne teknologier kræver høj kontrol af forsamling størrelse, magnetiske svar og termisk bestandighed. Blandinger af 1,2-dimyristoyl –sn– glycero-3-phosphocholine (DMPC) og dens lanthanide ion (Ln3 +) chelaterende phospholipid konjugat, 1,2-dimyristoyl –sn– glycero-3-phospho-ethanolamin-diethylenglycol triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), samles til stærkt magnetisk lydhør forsamlinger såsom DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molar forholdet 4:1:1) bicelles. Indførelsen af kolesterol (Chol-OH) og steroid derivater i tolagede resultater i et andet sæt af assemblies tilbyder unikke fysisk-kemiske egenskaber. For en given lipid sammensætning er den magnetiske alignability proportional med bicelle størrelse. Kompleks af Ln3 + resulterer i hidtil uset magnetiske svar med hensyn til både omfang og justering retning. Thermo-Vendbar sammenbrud af de disk-lignende strukturer i blærer ved opvarmning giver mulighed for tilpasning af forsamlinger dimensioner ved ekstrudering gennem membranfiltre med definerede pore størrelser. Magnetisk alignable bicelles regenereres ved afkøling til 5 ° C, hvilket resulterer i assembly dimensioner defineres af vesikel prækursorer. Heri, denne fabrikation procedure er forklarede og den magnetiske alignability forsamlinger er kvantificeret ved dobbeltbrydning målinger under en 5,5 T magnetfelt. Dobbeltbrydning signal, stammer fra tolagede phospholipid yderligere giver mulighed for overvågning af polymolecular forandringer i tolagede. Denne enkle teknik er et supplement til NMR eksperimenter, der er almindeligt anvendt til at karakterisere bicelles.
Bicelles er disk-lignende polymolecular forsamlinger hidrørende fra talrige lipid blandinger. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 de er meget udbredt til strukturel karakterisering af membran biomolekyler ved NMR spektroskopi. 6 , 7 imidlertid nylige indsats sigte at udvide feltet af mulige anvendelser. 5 , 8 , 9 den mest studerede bicelle-system består af en blanding af 1,2-dimyristoyl –sn– glycero-3-phosphocholine (DMPC), der udgør den plane del af forsamlingen, og 1,2-dihexanoyl –sn– glycero-3-phosphocholine (DHPC) Fosfolipid dækker kanten. 1 , 2 , 3 den molekylære geometri af fosfolipider komponere tolagede diktere arkitektur af selvsamlede polymolecular struktur. 4 , 5 udskiftning af DHPC med DMPE-DTPA genererer stærkt magnetisk responsiv og justerbar bicelle systemer. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molar forholdet 4:1:1) bicelles forbinder med mange flere Paramagnetiske lanthanide ioner (Ln3 +) på den tolagede overflade, hvilket resulterer i en forbedret magnetiske svar. 10 desuden erstatter de vandopløselige DHPC molekyler med DMPE-DTPA/Ln3 + muliggør dannelsen af fortynding-resistente bicelles. 11
Den magnetiske alignability af plane polymolecular forsamlinger er dikteret af deres samlede magnetiske energi,
(1)
hvor B er magnetisk feltstyrke, den magnetiske konstant, n sammenlægning antallet og
molekylære diamagnetic modtagelighed anisotropy af lipider komponere tolagede. Svar af DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles for magnetiske felter er derfor skræddersyet ved deres størrelse (samlet antal n) og molekylære diamagnetic modtagelighed anisotropy Δχ. Sidstnævnte er let opnås ved at ændre karakteren af den chelaterede Ln3 +. 12 , 13 , 14 , 15 indførelse kolesterol (Chol-OH) eller andre steroid derivater i tolagede giver mulighed for tuning både den samlede tal n og magnetiske modtagelighed Δχ forsamlinger. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 for en given lipid sammensætning, større forsamlinger indeholder flere lipider i stand til at bidrage til Emag (større samlede tal n), hvilket resulterer i mere alignable arter. Størrelsen af DMPC/DHPC bicelles, for eksempel, er konventionelt kontrolleret gennem optimering af at komponere lipid forholdet eller total koncentration. 20 , 21 , 22 selv om dette er muligt i DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles, deres thermo-reversibel transformation fra bicelle til vesikler på varme tilbud tilføjet indstillinger, skrædder. Mekanisk betyder såsom ekstrudering gennem membranfiltre giver mulighed for udformningen af vesikler. Magnetisk alignable bicelles regenereres ved afkøling til 5 ° C og deres dimensioner er dikteret fra vesikel prækursorer. 11 Herein, vi fokuserer på potentialet i mekanisk fabrikation procedurer med DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) som referencesystemer. Processen fungerer analogt når du arbejder med andre Ln3 + end Tm3 +. Den brede vifte af muligheder, som disse teknikker er fremhævet i figur 1 og flittigt diskuteret andetsteds. 23
Figur 1: skematisk oversigt over de mulige fabrikation procedurer. De studerede magnetisk alignable Ln3 + chelaterende polymolecular forsamlinger er sammensat af enten DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5). Tør lipid film er hydreret med en 50 mM fosfat buffer på en pH værdi på 7,4 og den samlede lipid koncentration er 15 mM. En effektiv hydrering af lipid film kræver enten fryse optøningen cyklusser (FT) eller opvarmning og afkøling cyklusser (H & C). H & C cyklusser er nødvendigt at regenerere prøver efter sidste fryse optøning trin eller regenerere prøver opbevares frosset over en længere periode, hvis de skal anvendes uden yderligere ekstrudering. Disse trin er udførligt drøftet af Isabettini mfl. 23 maksimalt alignable polymolecular forsamlinger er opnået, leverer forskellige forsamling arkitekturer baseret på lipid sammensætning. Bicelle størrelse og magnetiske alignability er afstemmelige ved ekstrudering (Ext) gennem nanopore membranfiltre. Præsenteres justering faktorer Af blev beregnet fra 2D small angle neutron scattering (SANS) mønstre af en DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) prøve ekstruderet gennem enten 800, 400, 200 eller 100 nm porer. SANS målinger er et supplerende middel til at kvantificere bicelle justering, der ikke er dækket i detaljer heri. 11 , 16 the Af varierer fra -1 (parallel neutron spredning eller vinkelret justering af bicelles med hensyn til retningen magnetfelt) til 0 for isotropic spredning.Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Strukturen af bicelles er blevet grundigt undersøgt af en bred vifte af karakterisering teknikker. 13 justeringen af bicelles udsat for et magnetfelt har opgjort ved hjælp af enten NMR spektroskopi eller small angle neutron scattering (SANS) eksperimenter. 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 dog skiftet og udvidelse af NMR toppe opstår ved tilstedeværelse af Ln3 + er alvorlige begrænsninger til metoden. 15 , 26 , 27 , 28 skønt SANS eksperimenter lider ikke af denne begrænsning, alternative og mere tilgængelige teknikker er ønskeligt for rutinemæssig kvantificering af magnetisk induceret tilpasning af forsamlinger i løsning. Dobbeltbrydning målinger er en levedygtig og forholdsvis enkle alternativ. Analogt til NMR eksperimenter afsløre dobbeltbrydning målinger værdifulde oplysninger om lipid rearrangementer og lipid faser forekommer i tolagede. Derudover overvåges geometriske transformationer forekommer i polymolecular forsamlingen med skiftende miljøforhold som temperaturen. 11 , 12 , 13 , 16 magnetisk induceret dobbeltbrydning Δn′ har været brugt til at studere forskellige former for phospholipid systemer. 13 , 29 , 30 dobbeltbrydning målinger baseret på fase modulationsteknik i et magnetfelt er en levedygtig metode til at registrere retningen af bicelles. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 mulighed for at undersøge bicelles med dobbeltbrydning i høje magnetfelter op til 35 T også blev demonstreret gennem M. Liebi et al. 13
Når polariseret lys ind en anisotrope materiale, vil det være brydes i en ordinære og ekstraordinære bølge. 11 de to bølger har forskellige hastigheder og er flyttet i fase af en retardering δ. Grad af retardering δ er målt og omdannet til et flydende signal at kvantificere graden af anisotropy i den materielle hjælp
(2)
hvor λ er bølgelængden af laser og d er tykkelsen af prøven. Fosfolipider er optisk anisotrope og deres optiske akse er sammenfaldende med deres lange molekylære akser, parallelt med kulbrinte haler. 11 , 12 ingen retardering måles hvis Fosfolipiderne er tilfældigt orienteret i løsning. Retardering er målt når fosfolipider er justeret parallelt med hinanden. Den magnetisk induceret dobbeltbrydning kan have en positiv eller negativ fortegn afhængigt af retningen af molekyler i det magnetiske felt; Se figur 2. Fosfolipider justeret parallelt til x-aksen vil resultere i en negativ
, mens de justeret langs z-aksen resultere i en positiv
. Ingen dobbeltbrydning er observeret, når den optiske akse falder sammen med ledelse af lys formering som phospholipid justerer parallel med y-aksen.
Figur 2: Justering af fosfolipider og tilsvarende tegn på den magnetisk induceret dobbeltbrydning . Tegnet af den målte
afhænger af orientering af fosfolipid i magnetfeltet. Stiplede linjer angiver den optiske akse af molekylet. Lyset er polariseret på 45° og udbreder i y-retningen. Det magnetiske felt B er i z retning. Dette tal er blevet ændret fra M. Liebi. 11 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
I tilfælde af en isotropic kolloid suspension af bicelles bliver orientering induceret af arrangement af fosfolipider i tolagede tabt, nulstilling retardering δ. Bicelles skal også justere for at orientere de optisk aktiv fosfolipider i deres dobbeltlag, forårsager en retardering δ af polariseret lys. Dobbeltbrydning er derfor en følsomme redskab til at kvantificere den magnetiske alignability polymolecular forsamlinger. Bicelles justeres vinkelret på det magnetiske felt vil give en positiv , mens de justeret parallelt vil give en negativ
. Tegn afhænger af justeringen af opsætningen og kan kontrolleres med en kontrolprøve.
En detaljeret redegørelse for hvordan dobbeltbrydning målinger blev brugt i kombination med SANS eksperimenter til at vurdere metoder til at generere meget magnetisk lydhør Ln3 + chelaterende fosfolipider forsamlinger er i Isabettini et al. 23 de foreslåede fabrikation protokoller er også gældende for assemblies, der består af de længere DPPC og DPPE-DTPA fosfolipider eller for dem, der indeholder kemisk manipuleret steroid derivater i deres tolagede. …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender den schweiziske National Science Foundation for finansiering SMhardBi (projekt nummer 200021_150088/1). SANS eksperimenter blev udført på den schweiziske spallation neutron kilde SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen i Schweiz. Forfatterne takke varmt Dr. Joachim Kohlbrecher til hans vejledning med SANS eksperimenter. Opsætningen dobbeltbrydning måling under høje magnetfelter var inspireret af den eksisterende opsætning ved høj-felt magnetiske laboratory HFML, Nijmegen, Nederlandene. Vi takke Bruno Pfister for hans hjælp i udvikle elektronik af opsætningen dobbeltbrydning, Jan Corsano og Daniel Kiechl til at konstruere rammer tillader fine og letkøbt justering af laser og Dr. Bernhard Koller til løbende tekniske support.
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | >99% |
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) | Avanti Polar Lipids | 790535P | >99% |
Thulium(III) chloride | Sigma-Aldrich | 439649 | anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis |
Dysprosium(III) chloride | Sigma-Aldrich | 325546 | anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis |
Ytterbium(III) chloride | Sigma-Aldrich | 439614 | anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 319988 | contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8% |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | ≥99.9% |
Cholesterol | Amresco | 433 | Ultra pure grade |
D2O | ARMAR chemicals | 1410 | 99.8 atom % D |
Ultrapure water | Millipore | Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001) | |
electronic pH meter | Metrohm | 17440010 | |
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter | VWR | 515-2028 | |
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter | VWR | 515-2029 | |
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter | VWR | 515-2030 | |
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter | VWR | 515-2032 | |
Whatmann Filter paper | VWR | 230600 | |
25 ml round bottom flask | VWR | 201-1352 | 14/23 NS |
3 ml glass snap-cup | VWR | 548-0554 | ND18, 18x30mm |
2.5 ml glass syringe | Hamilton | ||
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Merk | 1.06342 | Salt used to make phosphate buffer |
di-Sodium hydrogen phosphate | Merk | 1.06586 | Salt used to make phosphate buffer |
Liquid Nitrogen | Carbagas | – | |
Pressurized Nitrogen gas | Carbagas | – | 200 bar bottle |
Lipid Extruder 10 ml | Lipex | – | Fully equipped with thermobarrel |
High-pressure PVC tube | GR NETUM | – | must resist more than 4 MPa |
Serto adaptors | Sertot | – | |
Nitrile gloves | VWR | – | |
2 ml glass pipettes | VWR | 612-1702 | 230 mm long |
Diode Laser | Newport | LPM635-25C | |
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier | SRS | SR830 | |
Photodiode Detector | Silonex Inc. | SLSD-71N5 | 5mm2, Silicon, photo-conductive |
5.5 T Cryogenic Magnetic | Cryogenic/Oerlikon AG | – | 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head |
Second order low pass filter | home-built | – | Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA |
Photoelastic modulator | Hinds instruments | PEM-90 | |
Glan-Thompson Calcite Polarizer | Newport | 10GT04 | 25.4mm diameter |
Quartz sample cuvette | Hellma | 165-10-40 | temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length |
Temperature probe | Thermocontrol | – | Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax |
Non-polarizing mirrors | Newport | 50326-1002 | 25.4mm |
RS 232 cables | National Instruments | 189284-02 | For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers |
BNC 50 Ω cable and connectors | National Instruments | 763389-01 | |
cFP-AI-110 | National Instruments | 777318-110 | 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint |
cFP-CB-1 | National Instruments | 778618-01 | Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O |
cFP-CB-3 | National Instruments | 778618-03 | Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module |
cFP-TC-120 | National Instruments | 777318-120 | 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint |
cFP-1804 | National Instruments | 779490-01 | Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint |
LabView 2010 | National Instruments | – | |
Industrial power supply | Traco Power | TCL 060-124 | 100-240V AC |
Waterbath | Julabo | FP40-HE | refrigerated/Heating Circulator |