Procedimentos de fabricação e medições de birrefringência por projetar Lanthanide magneticamente responsivo Ion quelantes Phospholipid assembleias

Summary

Processos de fabricação de iões lantanídeos magneticamente altamente responsivo quelantes polymolecular assemblies são apresentados. A resposta magnética é ditada pelo tamanho montagem, que é adaptado por extrusão através de membranas nanopore. As assembleias alignability magnética e temperatura induzido por alterações estruturais são monitoradas por medições de birrefringência, uma técnica complementar de ressonância magnética nuclear e a dispersão de nêutrons de ângulo pequeno.

Abstract

Bicelles são assemblies sintonizável disco-como polymolecular, formados a partir de uma grande variedade de misturas de lipídios. Aplicações variam estudos estruturais de membrana proteínas por ressonância magnética nuclear (NMR) aos desenvolvimentos nanotecnológicos, incluindo a formação de géis opticamente ativos e magneticamente comutáveis. Essas tecnologias exigem alto controle do tamanho da montagem, resposta magnética e resistência térmica. Misturas de 1,2-dimyristoyl –sn– glicero-3-fosfocolina (ácido) e os seus iões lantanídeos (Ln^{3 +}) quelantes conjugado de fosfolípidos, 1,2-dimyristoyl –sn– glicero-3-fosfo-etanolamina-dietileno triaminepentaacetate ( DMPE-DTPA), montar em assemblies magneticamente altamente responsivos tais como ácido/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (razão molar 4:1:1) bicelles. Introdução de colesterol (Chol-OH) e esteroides derivados nos resultados da bicamada em outro conjunto de módulos (assemblies) oferecendo propriedades físico-químicas únicas. Para uma composição de lipídios determinado, a alignability magnética é proporcional ao tamanho do bicelle. A complexação de Ln^{3 +} resulta em respostas magnéticas sem precedentes em termos de magnitude e o alinhamento de direção. O thermo-reversível colapso das estruturas disco-como em vesículas após aquecimento permite alfaiataria de dimensões os assemblies por extrusão através de filtros de membrana com tamanhos definidos dos poros. Os magneticamente ajustável em bicelles são regenerados por resfriamento a 5 ° C, resultando em montagem dimensões definidas pelos precursores de vesículas. Neste documento, este processo de fabricação é explicado e a alignability magnética das assembleias é quantificada através de medições de birrefringência sob 5.5 T campo magnético. O sinal de birrefringência, provenientes da bicamada de fosfolípidos, mais permite o monitoramento de mudanças polymolecular que ocorrem na BICAMADA. Esta técnica simples é complementar experiências NMR, que são comumente empregadas para caracterizar bicelles.

Introduction

Bicelles são polymolecular de disco-como conjuntos obtidos de várias misturas de lipídios. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} são amplamente utilizados para a caracterização estrutural de membrana biomoléculas por espectroscopia RMN. ^{6 , 7} no entanto, os recentes esforços visam expandir o campo de aplicações possíveis. ^{5 , 8 , 9} o sistema bicelle mais estudado é composto por uma mistura de 1,2-dimyristoyl –sn– glicero-3-fosfocolina (ácido), que constituem a parte plana da Assembleia e 1,2-dihexanoyl –sn– glicero-3-fosfocolina (DHPC) fosfolipídeo cobrindo a borda. ^{1 , 2 , 3} a geometria molecular do compondo a BICAMADA de fosfolipídios ditar a arquitetura da estrutura de polymolecular Self montado. ^{4 , 5} substituir DHPC com DMPE-DTPA gera sistemas bicelle magneticamente altamente responsivo e ajustáveis. ^{10 , 11} ácido/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (razão molar 4:1:1) bicelles associar com muitos mais íons lantanídeos paramagnético (Ln^{3 +}) na superfície da bicamada, resultando em uma resposta magnética melhorada. ¹⁰ além disso, substituindo as moléculas hidrossolúveis de DHPC DMPE-DTPA/Ln^{3 +} permite que a formação de bicelles resistente a diluição. ¹¹

A alignability magnética das assembleias polymolecular planar é ditada pela sua energia magnética total,

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onde B é a intensidade do campo magnético, o magnético constante, n o número de agregação e a anisotropia de susceptibilidade diamagnético molecular dos lipídeos compondo a BICAMADA. Portanto, a resposta do ácido/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles a campos magnéticos é costurada por seu tamanho (n número agregado) e o Δχ de anisotropia de susceptibilidade diamagnético molecular. Este último é prontamente alcançado alterando a natureza do Ln quelatadas^{3 +}. ^{12 , 13 , 14 , 15} apresentando colesterol (Chol-OH) ou outros derivados de esteroides na BICAMADA oferece a possibilidade de ajuste tanto o agregado número n e o Δχ de susceptibilidade magnética dos assemblies. ^{11 , 16 , 17 , 18 , 19} para uma composição de lipídios determinado, maiores assemblies contêm lipídios mais capazes de contribuir para o E_mag (maior agregação número n), resultando em mais ajustável em espécie. O tamanho do ácido/DHPC bicelles, por exemplo, convencionalmente é controlado através da otimização da composição lipídica ratio ou total concentração. ^{20 , 21 , 22} embora isso seja possível em ácido/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles, sua transformação de thermo-reversível de bicelle para vesículas sobre ofertas de aquecimento adicionou opções de alfaiataria. Meios mecânicos, tais como extrusão através de filtros de membrana permite a formação das vesículas. Os magneticamente ajustável em bicelles são regenerados em cima de refrigerar a 5 ° C e suas dimensões são ditadas de precursores da vesícula. ¹¹ aquiem, focalizamos o potencial dos processos de fabricação mecânica com ácido/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 4:1:1) ou ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5) como sistemas de referência. O processo funciona de forma análoga ao trabalhar com outros Ln^{3 +} do que Tm^{3 +}. A vasta gama de possibilidades oferecidas por estas técnicas são destacadas na Figura 1 e amplamente discutido em outro lugar. ²³

Figura 1: visão geral esquemática dos procedimentos de fabricação possível. Os estudados magneticamente ajustável em Ln^{3 +} quelante polymolecular assemblies são compostas de qualquer ácido/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 4:1:1) ou ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5). O filme lipídico seco é hidratado com um tampão de fosfato de 50 milímetros em um valor de pH de 7,4 e a concentração de lipídios total é de 15 mM. Uma eficaz hidratação do filme lipídico requer também congelar descongelar ciclos (FT) ou aquecimento e arrefecimento ciclos (H & C). H & C ciclos são necessários para regenerar as amostras após a última congelar descongelar passo ou para regenerar as amostras mantidas congeladas durante um período prolongado de tempo, se eles devem ser usados sem mais extrusão. Estas etapas são discutidas extensivamente por Isabettini et al. ²³ polymolecular màxima ajustável em módulos (assemblies) é alcançados, entregando arquiteturas assembly diferente com base na composição lipídica. O tamanho de bicelle e alignability magnética é sintonizável por extrusão (Ext) através de filtros de membrana nanopore. O alinhamento apresentado fatores A_f foram calculados a partir de padrões de dispersão (SANS) de nêutrons 2D ângulos pequenos de uma amostra de ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5) extrudados através de 800, 400, 200 ou 100 nm poros. SANS medições são meios complementares de quantificar bicelle alinhamento que não será abordado em mais detalhes aqui. ^{11 , 16} o A_f varia de -1 (dispersão de nêutrons paralelo ou alinhamento perpendicular da bicelles em relação a direção do campo magnético) como 0 para dispersão isotrópica.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A estrutura do bicelles tem sido estudada extensivamente por uma vasta gama de técnicas de caracterização. ¹³ o alinhamento de bicelles expostos a um campo magnético foi quantificado usando espectroscopia RMN ou experimentos de espalhamento (SANS) ângulo pequeno neutrão. ^{5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25} no entanto, o turno e o alargamento dos picos NMR ocorrem na presença de Ln^{3 +} são sérias limitações para o método. ^{15 , 26 , 27 , 28} SANS embora experimentos não sofrem essa limitação, alternativa e técnicas mais acessíveis são desejáveis para quantificação de rotina de alinhamento magneticamente induzida de módulos (assemblies) em solução. Medições de birrefringência são uma alternativa viável e comparativamente simples. De forma análoga às experiências NMR, medições de birrefringência revelam informações valiosas sobre rearranjos de lipídios e fases de lipídios, ocorrendo na BICAMADA. Além disso, transformações geométricas, ocorrendo no assembly polymolecular com a mudança de condições ambientais, tais como a temperatura são monitoradas. ^{11 , 12 , 13 , 16} Δn′ birrefringência magneticamente induzida serviu para estudar vários tipos de sistemas de fosfolípidos. ^{13 , 29 , 30} medições de birrefringência, baseadas na técnica de modulação de fase em um campo magnético é um método viável para detectar a orientação de bicelles. ^{12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32} a possibilidade de investigar bicelles com birrefringência em altas campos magnéticos até 35 T também foi demonstrada por M. Liebi et al ¹³

Quando a luz polarizada entre um material anisotrópico, irá ser refratado em uma onda ordinária e extraordinária. ¹¹ as duas ondas têm velocidades diferentes e são transferidas em fase por um δ de retardo. O grau de retardo δ é medido e convertido em um sinal de birrefringência para quantificar o grau de anisotropia no utilizando material

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onde λ é o comprimento de onda do laser e d é a espessura da amostra. Fosfolipídios são opticamente anisotrópicos e seu eixo óptico coincide com seus eixos tempo moleculares, paralelamente as caudas de hidrocarbonetos. ^{11 , 12} sem atraso é medido se os fosfolípidos são orientados aleatoriamente na solução. Retardamento é medido quando fosfolípidos estão alinhados paralelamente uns aos outros. A birrefringência magneticamente induzida pode ter um sinal positivo ou negativo, dependendo da orientação das moléculas no campo magnético; consulte a Figura 2. Fosfolipídios alinhados paralelamente ao eixo x resultará em um negativo , enquanto que aqueles alinhados ao longo do eixo z positivo . Não birrefringência é observada quando o eixo ótico coincide com a direção de propagação de luz como o fosfolípido alinha paralelamente ao eixo y.

Figura 2: Alinhamento dos fosfolipídios e sinal correspondente a birrefringência magneticamente induzida . O sinal de que a medida varia de acordo com a orientação do phospholipid em campo magnético. Linhas tracejadas indicam o eixo óptico da molécula. A luz é polarizada a 45° e se propaga na direção y. O campo magnético B é na direção z. Esta figura foi modificada de M. Liebi. ¹¹ por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No caso de uma suspensão coloidal isotrópica de bicelles, a orientação induzida pelo arranjo dos fosfolipídios na BICAMADA serão perdida, zerando o δ de retardo. O bicelles também deve alinhar a fim de orientar os fosfolípidos opticamente ativos em seus bilayers, causando um retardo δ da luz polarizada. Consequentemente, birrefringência é uma ferramenta sensível para quantificar a alignability magnética das assembleias de polymolecular. Bicelles alinhados perpendicular ao campo magnético renderá um positivo , enquanto aqueles alinhados paralelamente renderá um negativo . O sinal varia de acordo com o alinhamento da instalação e pode ser verificado com uma amostra de referência.

Protocol

1. procedimento fabricação de ácido/DMPE-DTPA/Tm3 + (razão molar 4:1:1) e ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (razão molar 16:4:5:5) polymolecular assemblies Preparativos preliminares Lavagem do material de vidro por lavagem uma vez com etanol clorofórmio estabilizado (> 99% clorofórmio) e seque com ar comprimido. Produzir 2 10mg/mL distintas ações soluções de ácido e DMPE-DTPA em clorofórmio etanol-estabilizado (> 99% clorofórmio), uma solução de …

Representative Results

O sinal de birrefringência de um não-extrudados ácido/DMPE-DTPA/Tm3 + (razão molar 4:1:1) amostra foi monitorizada sob 5.5 T campo magnético durante um aquecimento e resfriamento ciclo de 5 a 40 ° C e volta a uma taxa de 1 ° C/min (Figura 6). Os resultados de birrefringência confirmaram alinhamentos magnéticos elevados a 5 ° C, com um valor de 1,5 x 10-5, duas vezes tão forte quanto os sistemas de extrusão relatados. <sup cla…

Discussion

Um relato detalhado de como as medições de birrefringência foram usadas em combinação com SANS experimentos para avaliar métodos para gerar magneticamente altamente responsivo Ln^{3 +} quelantes fosfolipídios assemblies é em Isabettini et al . ²³ os protocolos de fabricação proposto também são aplicáveis para assemblies compostos os mais fosfolipídios DPPC e DPPE-DTPA ou para aqueles que contêm derivados de esteroides quimicamente modificados em sua BICAMADA. <sup c…

Materials

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Thulium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439649	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Dysprosium(III) chloride	Sigma-Aldrich	325546	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Ytterbium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439614	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Chloroform	Sigma-Aldrich	319988	contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	≥99.9%
Cholesterol	Amresco	433	Ultra pure grade
D2O	ARMAR chemicals	1410	99.8 atom % D
Ultrapure water	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
electronic pH meter	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter	VWR	515-2032
Whatmann Filter paper	VWR	230600
25 ml round bottom flask	VWR	201-1352	14/23 NS
3 ml glass snap-cup	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
2.5 ml glass syringe	Hamilton
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Merk	1.06342	Salt used to make phosphate buffer
di-Sodium hydrogen phosphate	Merk	1.06586	Salt used to make phosphate buffer
Liquid Nitrogen	Carbagas	–
Pressurized Nitrogen gas	Carbagas	–	200 bar bottle
Lipid Extruder 10 ml	Lipex	–	Fully equipped with thermobarrel
High-pressure PVC tube	GR NETUM	–	must resist more than 4 MPa
Serto adaptors	Sertot	–
Nitrile gloves	VWR	–
2 ml glass pipettes	VWR	612-1702	230 mm long
Diode Laser	Newport	LPM635-25C
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier	SRS	SR830
Photodiode Detector	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silicon, photo-conductive
5.5 T Cryogenic Magnetic	Cryogenic/Oerlikon AG	–	12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
Second order low pass filter	home-built	–	Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Photoelastic modulator	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Calcite Polarizer	Newport	10GT04	25.4mm diameter
Quartz sample cuvette	Hellma	165-10-40	temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
Temperature probe	Thermocontrol	–	Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
Non-polarizing mirrors	Newport	50326-1002	25.4mm
RS 232 cables	National Instruments	189284-02	For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
BNC 50 Ω cable and connectors	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National Instruments	–
Industrial power supply	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Waterbath	Julabo	FP40-HE	refrigerated/Heating Circulator