基于3D 荧光显微镜的病毒转录工厂功能成像
Summary
病毒转录工厂是分散的结构, 富含细胞 RNA 聚合酶 II, 以增加病毒基因转录在重新激活。本文介绍了一种通过免疫荧光染色和原位RNA 杂交技术在3D 核空间中主动转录病毒染色质位置的方法。
Abstract
众所周知, 基因的时空调控是控制适当基因表达的一个组成部分。因此, 了解在核空间内发生转录的位置和时间, 以及在同一细胞核内感染 episomes 之间的关系是非常宝贵的。在这里, 免疫荧光 (IFA) 和 RNA 鱼已经 combinedto 识别积极转录卡波肉瘤相关的疱疹病毒 (KSHV) episomes。通过染色 KSHV 潜伏期相关的核抗原 (拉娜), 可以找到在细胞核内存在病毒 episomes 的地方。此外, 通过设计 rna 鱼探针来瞄准病毒基因的内含子区域, 这只在生产感染期间表达, 可以找到新生的 rna 转录。利用这种分子探针的组合, 可以可视化大型病毒转录工厂的组装, 分析 KSHV 活化过程中病毒基因表达的空间调节。通过包括抗 rna 聚合酶 ii 抗体染色, 你也可以可视化 rna 聚合酶 ii (RNAPII) 聚集和 KSHV 转录之间的关联在重新激活。
Introduction
越来越清楚的是, 原子核的时空组织在真核生物中调节微调基因表达中起着重要的作用。大多数组织特异性基因分布在许多染色体上, 需要同步调节, 以协调的方式响应特定的刺激1。细胞构建活性染色质中枢 (乙酰胆碱) 是一种将基因及其顺式调节成分汇集到特定核空间的方法1。
各种研究也表明, 尽管细胞核看起来非常致密和粘性, 但生物活性分子可以通过扩散2快速地穿过细胞核。由于这种短暂的性质, 大多数 DNA 结合蛋白 ‘ 跳跃 ‘ 从绑定站点到绑定站点, 感觉他们的方式周围的核空间, 这使得一个高度适应和多才多艺的核2。
尽管细胞核内的生物分子有这种动态行为, 但没有膜的核组织 (但不限于) 核仁、卡哈尔体和早幼粒细胞白血病核体 (PML) 仍然存在。它是通过各种机制, 如串联 DNA 重复 (核仁), rRNA (核仁) 和结构蛋白, 如 coilin (卡哈尔体) 或 pml 蛋白 (pml-NB), 持有这些构造一起3,4,5.这些结构和其他会众, 如转录工厂, 作为脚手架, 不仅增加了所需成分的局部浓度, 而且还调节了蛋白质和核酸的组成, 最终形成有效蜂窝功能的中心站点6。
对研究表观遗传学的研究人员来说, 核结构的形成提供了大量的信息。从病毒学的角度来看, 重新激活潜在感染病毒, 如 KSHV, 极大地改变了细胞核的景观和核酶的分布, 将转录主要从细胞基因转移到病毒基因, 最终生成功能完备的病毒子代7,8。KSHV 如何操纵细胞基因表达机制来促进病毒基因表达？这些信息也可以揭示颞细胞基因调控机制。
和所有其他疱疹一样, KSHV 有两个生命周期称为分解复制和延迟。KSHV 主要驻留在潜伏期阶段, 其中的大多数病毒基因表达是沉默的, 除了潜伏期相关基因9,10。在潜伏期 KSHV 产生潜伏期相关的核抗原 (拉娜), 其中组成结合病毒基因组和系病毒染色质的人类染色体11。由于拉娜与病毒基因组的密切关系, 有可能使用 IFA 和 DAPI 染色和定位的病毒 episomes 与寄主染色质。
为了研究 KSHV 在单个 episome 水平上的重新激活以及与感染细胞中其他病毒 episomes 的联系, 已经建立了一种在原位转录病毒染色质的有效方法。因此, 拉娜和 RNAPII IFA 与内含子 rna-鱼结合, 通过生成 rna 鱼探针, 绑定到内含子区域 (确切的探针序列可以发现在 Izumiya 实验室的最新出版物8) 的 KSHV K-贸易协定-关键的病毒蛋白, 是必要和足够的 KSHV 重新激活-它是可能的, 以确定何处转录实际上发生8,11,12,13,14,15.这种内含子 RNA-鱼技术使研究人员能够直观地看到 mRNA 在被剪接之前被转录到细胞质中, 然后被输出到胞浆16,17。
KSHV 可以重新激活的各种化学刺激, 包括佛波酯类, 如 12 O-Tetradeconoyl-佛波-13 醋酸盐 (TPA) 和组蛋白乙酰抑制剂, 如丁酸钠, 另外 KSHV 可以诱发活化的过度表达病毒转录因子, K-贸易协定19。研究人员成功地提高了 KSHV 激活的效率, 在诱导重新激活18之前同步细胞周期。因此, 对于这些特殊的研究, 细胞是同步使用双胸苷块 (协议描述), 并与 TPA 和强力霉素 (Dox) 孵育短时间。Doxycyline 的使用是因为这些实验中所用的细胞系有一种强力霉素诱导的 k-区域化盒, 它是从 cDNA 中克隆出来的, 不包括 k 区域的内含子区。虽然可以使用仅诱导的 k-KSHV 表达式来重新激活它, 但其他研究人员已经证明, 由于各种不同的生物化学因素, k-贸易协定的表达仅仅证明是一个微弱的活化刺激20。通过结合所有这些, 并通过限制药物孵化到短时间内, 一个强大的, 但不是过度人工 KSHV 的重新激活是实现了成像。
在对拉娜、RNAPII、K-的内含子和 DNA 进行标记后, 采用 widefield 反褶积显微镜进行3D 荧光成像。利用成像软件进行处理后, 可以正确评价活性病毒 episomes 的空间分布。利用这一技术, 可以研究关于形成活性染色质中枢和其他核结构的基本性质的核心问题。具有相同的病毒 episomes 在一个单一的细胞, 处理相同的调控元素可能代表一个独特的研究工具, 以加深对时空基因调控机制的理解。
在不同时间点固定的成像多细胞标本的局限性, 以表征一个固有的动态分子过程是, 微妙或小规模的变化, 荧光分布是不被发现或认为微不足道。这是事实, 除非在罕见的情况下, 每个细胞观察显示同样微妙的变化。因此, 有效的病毒转录和其他核结构的完全时空关系不能用固定成像进行严格的评估。为了解决这些技术难题, 最好的方法是对有标记的病毒 episomes 的活细胞进行图像处理, 并随着时间的推移, 跟踪关键细胞酶的位置。
Protocol
Representative Results
Discussion
该议定书的某些方面可以改变, 以适应不寻常的情况。固定和性缓冲的选择也可以改变。对于固定缓冲器, 甲醛也是有效的, 乙醇可用于性。
推荐用甘氨酸 pbs 猝灭甲醛, 因为它能防止甲醛在没有牛血清白蛋白 (BSA) 的情况下禁用抗体, 但如果片洗得足够彻底, 可以跳过甘氨酸 pbs 的步骤。在协议中, 避免使用牛血清白蛋白作为阻断溶液。在 Izumiya 实验室进行的试验研究显示, rna-鱼?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了国家卫生研究院 (R01-DE025985) 和美国癌症协会研究学者奖 (RSG-13-383-MPC) 的支持。这项工作还得到了美国农业部 (2015-67015-23268 和 2014-67015-21787) 的赠款和加利福尼亚大学戴维斯分校的新的研究计划赠款的支持。
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Referências
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