Functionele beeldvorming van virale transcriptie fabrieken met behulp van 3D fluorescentie microscopie
Summary
Virale transcriptionele fabrieken zijn discrete structuren die zijn verrijkt met cellulaire RNA polymerase II te verhogen van virale gen transcriptie tijdens reactivering. Hier, wordt een methode om te vinden sites van actief het transcriberen van virale chromatine in 3D-nucleaire ruimte door een combinatie van immunofluorescentie kleuring en in situ hybridisatie van RNA beschreven.
Abstract
Het is algemeen bekend dat regulering van de ruimtelijke en temporele van genen een integraal onderdeel is van het bestuur van de juiste genexpressie. Het is daarom van onschatbare waarde om te begrijpen waar en wanneer de transcriptie plaats binnen de nucleaire ruimte vindt en visualiseren van de relatie tussen episomes besmet binnen de dezelfde celkern. Hier, zowel de immunofluorescentie (IFA) en de RNA-vis geweest combinedto identificeren actief transcriberen Kaposisarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV) episomes. Door kleuring KSHV latency-associated nucleair antigeen (LANA), is het mogelijk om te zoeken waar de virale episomes bestaan in de kern. Bovendien, door het ontwerpen van RNA-vis sondes te richten op de regio intron van een virale gen, die alleen tijdens de productieve infectie wordt uitgedrukt, kunnen ontluikende RNA afschriften bevinden. Met deze combinatie van moleculaire sondes, is het mogelijk voor het visualiseren van de vergadering van grote virale transcriptie fabrieken en analyseren van de ruimtelijke verordening van virale genexpressie tijdens KSHV reactivering. Door anti-RNA polymerase II antilichaam kleuring, kunt een ook de vereniging tussen aggregatie van RNA polymerase II (RNAPII) en KSHV transcriptie tijdens reactivering visualiseren.
Introduction
Het steeds duidelijker dat de spatio organisatie van de kern een belangrijke rol speelt bij het moduleren van fijn-tuned genexpressie in eukaryoten geworden. Meeste weefsel specifieke genen zijn verdeeld over vele chromosomen en geregeld moeten worden synchroon om te reageren op specifieke stimuli in een gecoördineerde wijze1. Cellen bouwen actieve chromatine hubs (ACH) als een manier van het samenbrengen van genen en hun cis-regulerende componenten op een specifieke nucleaire ruimte1.
Ook is gebleken uit verschillende studies dat hoewel de kern zeer dichte en viskeuze lijkt, biologisch actieve moleculen de kern vrij snel via diffusie2 doorkruisen kunnen. Als gevolg van deze efemere eigenschap springen meeste DNA-bindende proteïnen’ ‘ van de site te binden aan de site, het gevoel van hun weg rond de nucleaire ruimte, die het mogelijk voor een zeer adaptief en veelzijdige kern2 maaktbindend.
Ondanks dit dynamische gedrag van biomoleculen binnen de kern, nucleaire organen zonder membranen zoals (maar niet beperkt tot) de nucleolus Cajal organen en de promyelocytic leukemie nucleaire organen (PML-NB) bestaan nog steeds. Het is door een aantal mechanismen zoals tandem DNA herhalingen (nucleolus), rRNA (nucleolus) en structurele proteïnen zoals coilin (Cajal instanties) of PML eiwitten (PML-NB) die houden van deze constructies samen3,4,5 . Deze structuren en andere congregaties zoals transcriptie fabrieken dienen als steigers die niet alleen de plaatselijke concentratie van vereiste onderdelen te verhogen, maar ook het reguleren van de samenstelling van eiwitten en nucleïnezuren binnen hen uiteindelijk maken een centrale site voor efficiënte cellulaire functies6.
Visualiseren van wanneer en waar nucleaire structuren vorm biedt een schat aan informatie aan onderzoekers bestuderen van de epigenetica. Vanuit een perspectief van de virologie, de reactivering van latent geïnfecteerde virussen, zoals KSHV, aanzienlijk verandert het landschap van de kern en de verspreiding van nucleaire enzymen verschuiving transcriptie voornamelijk van cellulaire genen naar virale genen, uiteindelijk te volledig functionele virale nageslacht7,8te produceren. Hoe KSHV de cellulaire gen expressie machines om virale genexpressie manipuleren? Dergelijke informatie kan ook licht werpen op tijdelijke cellulaire gene regulerende mechanismen.
KSHV heeft net als alle andere infectieziekte, twee levenscyclus genaamd lytische replicatie en latentie. KSHV bevindt zich voornamelijk in de latentie fase in die de meeste van haar virale gen expressie het zwijgen is opgelegd, behalve latency genen9,10 verbonden. Tijdens KSHV produceert latency verbonden latentie nucleair antigeen (LANA), die constitutively bindt het virale genoom en aanbinden van virale chromatine tot en met de menselijke chromosoom11. Vanwege LANA’s intieme relatie met het virale genoom is het mogelijk gebruik van IFA en DAPI vlek te zoeken waar de virale episomes waren ten opzichte van de chromatine host.
Studeren KSHV reactivering op één isomer niveau en de associatie met andere virale episomes in een geïnfecteerde cel, is een strategie om te zoeken actief transcriberen virale chromatine in situ opgezet. Dienovereenkomstig, LANA en RNAPII IFA met intron RNA-vis werden samengevoegd, door het genereren van sondes van RNA-vis die zich binden aan de intron regio (exacte sonde sequenties kunnen worden gevonden in de Izumiya lab’s meest recente publicatie8) van KSHV K-Rta-de belangrijkste virale eiwitten die is wezenlijke en voldoende voor KSHV reactivering-het was mogelijk om te identificeren waar transcriptie eigenlijk nam plaats8,11,12,13,14,15 . Deze intron RNA-vis techniek kan onderzoekers te visualiseren waar mRNA is wordt getranscribeerd onmiddellijk voordat het wordt verbinding aan de randen en geëxporteerd naar cytoplasma16,17.
KSHV kunnen opnieuw worden geactiveerd door verschillende chemische prikkels, met inbegrip van phorbol esters zoals 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) en histone deacetylase remmers zoals natrium butyraat, bovendien KSHV kunnen worden opgewekt reactiveren met overexpressie van de virale transcriptiefactor, K-Rta19. Onderzoekers hebben met succes de efficiëntie van KSHV reactivering stegen met synchroniseren van de cel cycli voorafgaand aan inducerende reactivering18. Dus, voor deze bijzondere studies, cellen zijn gesynchroniseerd met behulp van een dubbele thymidine blok (protocol hieronder beschreven) en geïncubeerd met TPA en doxycycline (Dox) voor een korte tijd. Doxycyline werd gebruikt omdat de cellijn gebruikt in deze experimenten heeft een doxycycline-afleidbare K-Rta cassette, die werd gekloond van cDNA en omvat niet de intron regio van K-Rta. Hoewel het mogelijk is te activeren met behulp van de KSHV alleen geïnduceerde K-Rta expressie, het is bewezen door andere onderzoekers dat wegens een verscheidenheid van verschillende biochemische factoren K-Rta expressie alleen blijkt te zijn van een zwakke reactivering stimuli20. Door het combineren van al deze, en door de beperking van de drug-incubations voor een korte periode van tijd, werd een robuuste maar niet overdreven kunstmatige KSHV reactivering bereikt voor imaging.
Na het labelen van LANA, RNAPII, K-Rta introns, en DNA als in dit artikel wordt beschreven, 3D fluorescentie imaging werd uitgevoerd met behulp van een Microscoop widefield deconvolutie. Na verwerking met beeldbewerkingssoftware, kan de ruimtelijke spreiding van actieve virale episomes naar behoren worden geëvalueerd. Met deze techniek kan kunnen de centrale vraagstukken met betrekking tot het fundamentele karakter van de vorming van actieve chromatine hubs en andere nucleaire structuren worden bestudeerd. Met identieke virale episomes in één cel die dezelfde regelgevende elementen verwerkt kan vertegenwoordigen een unieke onderzoeksinstrument te verdiepen van het inzicht in Spatio gene regulerende mechanismen.
Een beperking van imaging meerdere cel specimens vastgesteld op verschillende tijdstippen een inherent dynamische moleculaire proces karakteriseren is dat subtiele of kleinschalige wijzigingen in fluorescentie distributie onopgemerkt zijn of onbelangrijk geacht. Dit geldt tenzij in het zeldzame geval, elke cel waargenomen dezelfde subtiele wijziging weergegeven. Worden dus de volledige Spatio relatie en actieve virale schrijffouten en andere nucleaire structuren kan niet kritisch geëvalueerd met behulp van vaste imaging. De beste aanpak is om deze technische uitdagingen, afbeelding levende cellen die virale episomes gemarkeerd en volgen van de locatie van de belangrijkste cellulaire enzymen na verloop van tijd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn enkele aspecten van het protocol dat kan worden gewijzigd zodat ongewone omstandigheden. De keuze van fixatie en permeabilization buffers kan ook worden gewijzigd. Paraformaldehyde is ook effectief voor fixatie buffers, en ethanol kan worden gebruikt voor permeabilization.
Blussen de formaldehyde met glycine die PBS wordt aanbevolen als het formaldehyde verhindert het uitschakelen van de antilichamen in afwezigheid van bovien serumalbumine (BSA), maar als de coverslips worden gewassen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van de National Institutes of Health (R01-DE025985) en door een Amerikaans kanker maatschappij Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Dit werk werd ook ondersteund door subsidies van de U.S. Department of Agriculture (2015-67015-23268 en 2014-67015-21787) en het nieuwe initiatief onderzoeksbeurs van Universiteit van Californië, Davis.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Referências
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi’s sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
