3 डी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर वायरल प्रतिलेखन कारखानों के कार्यात्मक इमेजिंग
Summary
वायरल transcriptional कारखानों असतत संरचनाओं कि सेलुलर आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय से समृद्ध कर रहे है के लिए प्रतिक्रियाशीलता के दौरान वायरल जीन प्रतिलेखन वृद्धि कर रहे हैं । यहां, एक विधि सक्रिय रूप से 3 डी परमाणु अंतरिक्ष में इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और सीटू आरएनए संकरण में से एक संयोजन के द्वारा वायरल क्रोमेटिन लिखित की साइटों का पता लगाने के लिए वर्णित है ।
Abstract
यह सर्वविदित है कि स्थानिक और जीन के लौकिक विनियमन उचित जीन अभिव्यक्ति शासी का एक अभिंन हिस्सा है । नतीजतन, यह समझने के लिए अमूल्य है, जहां और जब प्रतिलेखन परमाणु अंतरिक्ष के भीतर जगह ले जा रहा है और एक ही कोशिका नाभिक के भीतर संक्रमित episomes के बीच संबंध कल्पना । यहाँ, दोनों इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आइएफए) और आरएनए-मछली सक्रिय रूप से combinedto Kaposi की सार्कोमा-एसोसिएटेड gerpevirusnoy (KSHV) episomes पहचान की गई है । KSHV विलंबता से जुड़े परमाणु प्रतिजन (लाना) दाग से, यह पता लगाने के लिए जहां वायरल episomes नाभिक के भीतर मौजूद संभव है । इसके अलावा, आरएनए-मछली जांच डिजाइन द्वारा एक वायरल जीन है, जो केवल उत्पादक संक्रमण के दौरान व्यक्त की है intron क्षेत्र को लक्षित करने के लिए, नवजात आरएनए टेप स्थित किया जा सकता है । आणविक जांच के इस संयोजन का उपयोग करना, यह बड़े वायरल टेप कारखानों के विधानसभा कल्पना और KSHV पुनर्सक्रियण के दौरान वायरल जीन अभिव्यक्ति के स्थानिक विनियमन विश्लेषण संभव है । विरोधी आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय एंटीबॉडी धुंधला सहित द्वारा, एक भी पुनः क्रियाशीलता के दौरान आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय (RNAPII) एकत्रीकरण और KSHV प्रतिलेखन के बीच संघ कल्पना कर सकते हैं.
Introduction
यह तेजी से स्पष्ट है कि नाभिक के spatiotemporal संगठन eukaryotes में पतले देखते जीन अभिव्यक्ति नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है हो गया है । अधिकांश ऊतक विशिष्ट जीन कई गुणसूत्रों पर वितरित कर रहे है और एक समंवित तरीके से1में विशिष्ट उत्तेजनाओं का जवाब देने के लिए तुल्यकालिक विनियमित किया जाना चाहिए । कोशिकाओं एक विशिष्ट परमाणु अंतरिक्ष1करने के लिए एक साथ जीन और उनके सीआईएस नियामक घटकों को लाने के एक तरीके के रूप में सक्रिय क्रोमेटिन हब () का निर्माण ।
यह भी विभिंन अध्ययनों द्वारा प्रदर्शित किया गया है कि हालांकि नाभिक बहुत घने और चिपचिपा लगता है, जैविक रूप से सक्रिय अणुओं नाभिक पार नहीं बल्कि जल्दी से प्रसार के माध्यम से कर सकते है2। इस अल्पकालिक संपत्ति का एक परिणाम के रूप में, बाइंडिंग साइट से सबसे डीएनए बंधन प्रोटीन ‘ छलांग ‘ बंधन साइट के लिए, परमाणु अंतरिक्ष के आसपास अपने रास्ते लग रहा है, जो एक उच्च अनुकूली और बहुमुखी नाभिक के लिए अनुमति देता है2।
नाभिक के भीतर इस तरह के अणुओं के गतिशील व्यवहार के बावजूद, जैसे झिल्ली के बिना परमाणु शरीर (लेकिन तक सीमित नहीं) nucleolus, Cajal निकायों, और promyelocytic ल्यूकेमिया परमाणु निकायों (पीएमएल-एनबी) अभी भी मौजूद हैं । यह ऐसे मिलकर डीएनए को दोहराता (nucleolus), rRNA (nucleolus) और संरचनात्मक प्रोटीन जैसे coilin (Cajal निकायों) या पीएमएल प्रोटीन (पीएमएल-NB) के रूप में इस तरह के तंत्र की एक किस्म के माध्यम से है कि इन का एक साथ निर्माण पकड़3,4,5 . इन संरचनाओं और प्रतिलेखन कारखानों जैसे अंय सभाओं मचान है कि न केवल आवश्यक घटकों के स्थानीय एकाग्रता बढ़ाने के रूप में सेवा है, लेकिन यह भी प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड की संरचना को विनियमित करने के लिए उंहें अंततः बनाने के लिए कुशल सेलुलर कार्यों के लिए केंद्रीय साइट6।
visualizing जब और जहां परमाणु संरचनाओं फार्म epigenetics अध्ययन शोधकर्ताओं को जानकारी का खजाना प्रदान करता है । एक वायरोलॉजी परिप्रेक्ष्य से, इस तरह के KSHV के रूप में अव्यक्त रूप से संक्रमित वायरस, के पुनर्क्रियाशीलता, काफी नाभिक और परमाणु एंजाइमों के वितरण के परिदृश्य को बदलने के लिए मुख्य रूप से सेलुलर जीन से प्रतिलेखन बदलाव वायरल जीन के लिए, अंततः पूरी तरह कार्यात्मक वायरल संतति7,8का उत्पादन । कैसे KSHV वायरल जीन अभिव्यक्ति की सुविधा के लिए सेलुलर जीन अभिव्यक्ति मशीनरी में हेरफेर करता है? इस तरह की जानकारी भी लौकिक सेलुलर जीन विनियामक तंत्र पर प्रकाश डाला सकता है ।
अंय सभी herpesviruses की तरह, KSHV दो जीवन चक्र lytic प्रतिकृति और विलंबता कहा जाता है । KSHV मुख्य रूप से विलंबता चरण में रहता है, जिसमें अपने वायरल जीन अभिव्यक्ति की सबसे खामोश है, सिवाय विलंबता जुड़े जीन9,10. विलंबता KSHV के दौरान विलंबता जुड़े परमाणु प्रतिजन (लाना) है, जो constitutively वायरल जीनोम और तार मानव गुणसूत्र11के लिए वायरल क्रोमेटिन बांध उत्पादन करता है । के वायरल जीनोम के साथ LANA अंतरंग संबंध के कारण, यह संभव है कि आइएफए और DAPI का उपयोग करने के लिए दाग और पता लगाने जहां वायरल episomes मेजबान क्रोमेटिन के संबंध में थे ।
एकल episome स्तर पर KSHV पुनर्सक्रियण का अध्ययन करने और संक्रमित कोशिका में अन्य वायरल episomes के साथ सहयोग करने के लिए, सीटू में सक्रिय रूप से टाइपिंग वायरल क्रोमेटिन का पता लगाने की रणनीति स्थापित की गई है । तदनुसार, LANA और RNAPII आइएफए intron आरएनए-मछली के साथ संयुक्त थे, आरएनए-मछली जांच है कि intron क्षेत्र के लिए बाध्य पैदा करके (सटीक जांच अनुक्रम KSHV K के सबसे हाल ही में प्रकाशन8में पाया जा सकता है)-आरटीए-कुंजी वायरल प्रोटीन है कि आवश्यक और KSHV पुनर्क्रियाशीलता के लिए पर्याप्त है-यह पहचान जहां प्रतिलेखन वास्तव में जगह8,11,12,13,14,15 . यह intron आरएनए-मछली तकनीक शोधकर्ताओं कल्पना करने के लिए सक्षम बनाता है, जहां mRNA पहले यह ब्याह किया जाता है और कोशिका करने के लिए निर्यात16,17.
KSHV जैसे 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (टीपीए) और citrullinated deacetylase अवरोधकों जैसे सोडियम butyrate के रूप में phorbol एस्टर सहित विभिन्न रासायनिक उत्तेजनाओं द्वारा पुनः सक्रिय किया जा सकता है, इसके अतिरिक्त KSHV के व्यक्त द्वारा पुनः सक्रिय करने के लिए प्रेरित किया जा सकता वायरल टेप फैक्टर, कश्मीर-आरटीए19। शोधकर्ताओं ने सफलतापूर्वक पुनर्क्रियाशीलता उत्प्रेरण से पहले सेल के चक्र को सिंक्रनाइज़ करके KSHV पुनर्सक्रियण की दक्षता में वृद्धि की है18. इस प्रकार, इन विशेष अध्ययन के लिए, कोशिकाओं को एक डबल thymidine ब्लॉक (प्रोटोकॉल के नीचे वर्णित) का उपयोग कर सिंक्रनाइज़ किया गया और टीपीए और doxycycline (Dox) के साथ एक कम समय के लिए मशीन । Doxycyline उपयोग किया गया था क्योंकि इन प्रयोगों में उपयोग की गई सेल लाइन में एक doxycycline-inducible k-आरटीए कैसेट है, जिसे सीडीएनए से क्लोन किया गया था और इसमें k-आरटीए का intron क्षेत्र शामिल नहीं है । हालांकि यह केवल प्रेरित k-आरटीए अभिव्यक्ति का उपयोग कर KSHV को पुनः सक्रिय करने के लिए संभव है, यह अन्य शोधकर्ताओं द्वारा सिद्ध किया गया है कि विभिन्न जैव रासायनिक कारकों की एक किस्म के कारण कश्मीर-आरटीए अभिव्यक्ति अकेले एक कमजोर reसक्रियण उत्तेजनाओं20साबित होता है. इन सभी के संयोजन से, और समय की एक छोटी अवधि के लिए दवा की मशीन को सीमित करके, एक मजबूत लेकिन नहीं पीढ़ी कृत्रिम KSHV पुनर्क्रियाशीलता इमेजिंग के लिए प्राप्त किया गया था ।
के बाद लेबल LANA, RNAPII, K-आरटीए introns, और डीएनए के रूप में इस पत्र में वर्णित, 3d प्रतिदीप्ति इमेजिंग एक widefield deconvolution माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ प्रसंस्करण के बाद, सक्रिय वायरल episomes के स्थानिक वितरण ठीक से मूल्यांकन किया जा सकता है । इस तकनीक का प्रयोग करते हुए, सक्रिय क्रोमेटिन केन्द्रों और अन्य नाभिकीय संरचनाओं के गठन के मौलिक स्वरूप के संबंध में केंद्रीय प्रश्नों का अध्ययन किया जा सकता है । एक ही सेल है कि एक ही नियामक तत्वों प्रक्रियाओं में समान वायरल episomes होने spatiotemporal जीन विनियामक तंत्र की समझ को गहरा करने के लिए एक अनूठा अनुसंधान उपकरण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं ।
इमेजिंग एकाधिक सेल अलग समय अंक पर तय नमूनों की एक स्वाभाविक गतिशील आणविक प्रक्रिया की सीमा है कि सूक्ष्म या छोटे पैमाने प्रतिदीप्ति वितरण में परिवर्तन नहीं पता चला रहे है या तुच्छ समझा । यह सही है जब तक कि दुर्लभ उदाहरण में, हर कोशिका मनाया समान सूक्ष्म परिवर्तन प्रदर्शित करता है । इस प्रकार, सक्रिय वायरल प्रतिलेखन और अंय परमाणु संरचनाओं का पूरा spatiotemporal संबंध गंभीर रूप से तय इमेजिंग का उपयोग कर मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है । इन तकनीकी चुनौतियों का पता करने के लिए, सबसे अच्छा तरीका वायरल episomes चिह्नित किया है और समय के साथ प्रमुख सेलुलर एंजाइमों के स्थान का पालन करने के लिए है कि छवि जीवित कोशिकाओं के लिए है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वहां प्रोटोकॉल है कि असामांय परिस्थितियों को समायोजित बदला जा सकता है के कुछ पहलुओं रहे हैं । निर्धारण और permeabilization के चुनाव भी बदले जा सकते थें. निर्धारण बफ़र्स के लिए, paraformaldehyde भी प्रभावी है और इथेनॉल permeabilization…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान (R01-DE025985) द्वारा समर्थित किया गया था और एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी रिसर्च विद्वान पुरस्कार (RSG-13-383-MPC) द्वारा । यह काम भी अमेरिका के कृषि विभाग से अनुदान द्वारा समर्थित (2015-67015-23268 और 2014-67015-21787) और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस से नए अनुसंधान पहल अनुदान था ।
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
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