Imaging funzionale delle fabbriche di trascrizione virale utilizzando la microscopia a fluorescenza 3D
Summary
Fabbriche di transcriptional virali sono strutture discrete che sono arricchiti con cellulare RNA polimerasi II per aumentare la trascrizione genica virale durante la riattivazione. Qui, è descritto un metodo per individuare i siti di trascrivere attivamente della cromatina virale nello spazio 3D nucleare da una combinazione di ibridazione di RNA immunofluorescenza colorazione ed in situ .
Abstract
È noto che la regolazione spaziale e temporale dei geni è parte integrante di che regolano l’espressione genica corretto. Di conseguenza, è prezioso per comprendere dove e quando trascrizione avviene all’interno dello spazio nucleare e per visualizzare la relazione tra episomi infettata all’interno del nucleo della cellula stessa. Qui, l’immunofluorescenza (IFA) e RNA-pesce sono stati combinedto identificare attivamente trascrivere episomi herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi (KSHV). Dalla macchiatura antigene nucleare associato latenza KSHV (LANA), è possibile individuare dove episomi virali esistano all’interno del nucleo. Inoltre, progettando sonde di RNA-pesce di destinazione della regione di introne di un gene virale, che è espressa solo durante l’infezione produttiva, nascente trascrizioni del RNA possono essere situate. Utilizzando questa combinazione di sonde molecolari, è possibile visualizzare l’assemblaggio di fabbriche di grande trascrizione virale e analizzare il regolamento spaziale dell’espressione genica virale durante la riattivazione di KSHV. Includendo la macchiatura dell’anticorpo di anti-RNA polimerasi II, si può anche visualizzare l’associazione fra l’aggregazione di RNA polimerasi II (RNAPII) e la trascrizione di KSHV durante la riattivazione.
Introduction
È diventato sempre più chiaro che l’organizzazione spazio-temporale del nucleo svolge un ruolo importante nella modulazione della espressione genica finemente sintonizzato negli eucarioti. Maggior parte dei geni specifici del tessuto sono distribuiti su molti cromosomi e devono essere disciplinati in modo sincrono al fine di rispondere a stimoli specifici in un modo coordinato1. Le cellule costruire mozzi di cromatina attiva (ACH) come un modo di riunire su un specifico spazio nucleare1geni e loro elementi cis-regolatori.
Inoltre è stato dimostrato da diversi studi che sebbene il nucleo sembra molto denso e viscoso, molecole biologicamente attive possono attraversare il nucleo piuttosto rapidamente tramite diffusione2. In conseguenza di questa struttura effimera, la maggior parte delle proteine che legano DNA ‘saltare’ da sito di associazione all’associazione sito, sentire loro modo intorno allo spazio nucleare, che permette per un nucleo altamente adattabile e versatile2.
Nonostante questo comportamento dinamico di biomolecole all’interno del nucleo, nucleare corpi senza membrane come (ma non limitato a) il nucleolo, i corpi di Cajal e corpi nucleari di promyelocytic leucemia (PML-NB) esistono ancora. È attraverso una varietà di meccanismi quali ripetizioni in tandem di DNA (nucleolo), rRNA (nucleolo) e proteine strutturali quali coilina (Cajal bodies) o PML proteine (PML-NB) che tengono questi costrutti insieme3,4,5 . Queste strutture e altre congregazioni come le fabbriche di trascrizione fungono da impalcature che non solo aumentano la concentrazione locale dei componenti richiesti, ma anche regolano la composizione di proteine ed acidi nucleici all’interno di essi, in definitiva, creare un sito centrale per efficienti funzioni cellulari6.
Visualizzare quando e dove il modulo di strutture nucleari fornisce una ricchezza di informazioni per i ricercatori che studiano l’epigenetica. Da una prospettiva di virologia, la riattivazione del virus latente infettati, come KSHV, altera significativamente il paesaggio del nucleo e la distribuzione di enzimi nucleari per spostare la trascrizione principalmente da geni cellulari a geni virali, in ultima analisi, per produzione di progenie virale completamente funzionale7,8. Come KSHV manipolare il macchinario di espressione di gene cellulare per facilitare l’espressione genica virale? Tali informazioni potrebbero anche far luce su meccanismi di regolazione genica cellulare temporale.
Come tutti gli altri virus erpetici, KSHV ha due cicli di vita chiamati latenza e replica litica. KSHV risiede principalmente nella fase di latenza, in cui la maggior parte del relativo gene virale espressione viene messo a tacere, tranne la latenza associata geni9,10. Durante la latenza che KSHV produce latenza associata antigene nucleare (LANA), che costitutivamente lega i genomi virali e attacchi virali della cromatina del cromosoma11. A causa della relazione intima di LANA con il genoma virale, è possibile utilizzare IFA e DAPI per macchiare ed individuare dove gli episomi virali erano in relazione la cromatina di host.
Per studiare la riattivazione di KSHV a livello di singolo episome e l’associazione con altri episomi virali in una cellula infetta, è stata stabilita una strategia per individuare attivamente trascrizione virale della cromatina in situ . Di conseguenza, sono stati combinati LANA e RNAPII IFA con introne RNA-pesce, generando sonde di RNA-FISH che si legano alla regione dell’introne (sonda esatta sequenze possono essere trovate in più recente pubblicazione8 del laboratorio Izumiya) di KSHV K-Rta-la proteina virale chiave che è essenziali e sufficienti per KSHV riattivazione-era possibile identificare dove trascrizione in realtà stava prendendo posto8,11,12,13,14,15 . Questa tecnica di RNA-pesce introne consente ai ricercatori di visualizzare dove mRNA è essere trascritte immediatamente prima di essere impiombato ed esportato in citoplasma16,17.
KSHV può essere riattivato da vari stimoli chimici tra cui esteri di phorbol come 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) e inibitori delle deacetilasi istoniche quale il butirrato di sodio, inoltre KSHV possono essere indotte a riattivare dall’iperespressione di il fattore di trascrizione virale, K-Rta19. I ricercatori hanno aumentato con successo l’efficienza della riattivazione di KSHV sincronizzando cicli della cella prima di indurre la riattivazione18. Così, per questi studi particolari, le cellule sono state sincronizzate utilizzando un blocco di doppia timidina (protocollo descritto di seguito) e incubati con TPA e doxiciclina (Dox) per un breve periodo. Doxycyline è stato utilizzato perché la linea cellulare utilizzata in questi esperimenti ha una cassetta di K-Rta doxiciclina-inducibile, che è stata clonata da cDNA e non include la regione di introne di K-Rta. Anche se è possibile riattivare KSHV utilizzando solo ha indotto l’espressione di K-Rta, è stato dimostrato da altri ricercatori che a causa di una varietà di differenti fattori biochimici espressione K-Rta da solo dimostra di essere un debole riattivazione stimoli20. Combinando tutte queste e limitando le incubazioni di droga per un breve periodo di tempo, una riattivazione di KSHV robusta ma non eccessivamente artificiale è stata realizzata per l’imaging.
Dopo l’etichettatura LANA, RNAPII, K-Rta introni e DNA come descritti in questa carta, fluorescenza 3D imaging è stata eseguita utilizzando un microscopio di deconvoluzione widefield. Dopo l’elaborazione con software di imaging, la distribuzione spaziale degli episomi virali attive possa essere valutata correttamente. Utilizzando questa tecnica, le questioni centrali per quanto riguarda la natura fondamentale della formazione della cromatina attiva mozzi e altre strutture nucleari possono essere studiate. Avendo identici episomi virali in una singola cella che elabora gli stessi elementi normativi può rappresentare uno strumento di ricerca unico per approfondire la comprensione dei meccanismi di regolazione genica spatiotemporal.
Una limitazione di imaging più campioni di cella fissati in diversi momenti per caratterizzare un processo intrinsecamente dinamico molecolare è che sottili o piccoli cambiamenti nella distribuzione di fluorescenza sono inosservati o ritenute insignificanti. Questo è vero a meno che nel caso raro, ogni cellula osservato Visualizza lo stesso cambiamento sottile. Così, il rapporto completo spatiotemporal di trascrizione virale attiva e altre strutture nucleari non può essere valutato criticamente usando la formazione immagine fissa. Per affrontare queste sfide tecniche, l’approccio migliore è di cellule vive di immagine che hanno segnato episomi virali e di seguire la posizione di enzimi cellulari chiave nel corso del tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono alcuni aspetti del protocollo che può essere modificato per accogliere le circostanze insolite. La scelta di fissazione e permeabilization buffer può anche essere alterata. Per i buffer di fissazione, è efficace anche paraformaldeide ed etanolo può essere utilizzato per la permeabilizzazione.
Tempra la formaldeide con glicina che PBS è raccomandato in quanto impedisce formaldeide disabilitando gli anticorpi in assenza di albumina di siero bovino (BSA), ma se le lamelle vengono lav…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da grant National Institutes of Health (R01-DE025985) e da un American Cancer Society ricerca Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Questo lavoro è stato anche supportato da concessioni dal US Department of Agriculture (2015-67015-23268 e 2014-67015-21787) e nuova concessione di iniziativa di ricerca presso University of California, Davis.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Referências
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