حليب الثدي يعزز نمو انتيرويدس: نموذج فيفو السابقين من تكاثر الخلايا
Summary
هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء نظام ثقافة انتيرويد من الماوس الولدان أو الأمعاء البشرية المبكرة، فضلا عن طريقة فعالة لجمع الحليب من الفئران.
Abstract
البشرية الصغيرة انتيرويدس المعوية مستمدة من الأقبية وعندما تزرع في خلايا الجذعية متخصصة تحتوي على جميع أنواع الخلايا الظهارية. القدرة على وضع انتيرويد البشر السابقين فيفو ثقافة نظم مهمان لنموذج المعوية الفيزيولوجيا المرضية ودراسة الاستجابات الخلوية خاصة المعنية. في السنوات الأخيرة، انتيرويدس من البشر والفئران التي تستزرع، باساجيد، وراهن بعيداً لاستخدامها في المستقبل في عدة مختبرات عبر العالم. يمكن استخدام هذا النظام الأساسي انتيرويد لاختبار آثار مختلف العلاجات والأدوية، وما هي الآثار التي تمارس على أنواع مختلفة من الخلايا في الأمعاء. هنا، على بروتوكول لإنشاء الأولية المستمدة من الخلايا الجذعية الصغيرة المعوية انتيرويدس المستمدة من الفئران حديثي الولادة ويتم توفيرها من الأمعاء البشرية سابقا لأوانه. وعلاوة على ذلك، استخدمت هذا النظام الثقافي انتيرويد لاختبار آثار حليب الثدي إبلاغها. حليب الثدي الماوس يمكن الحصول على كفاءة استخدام مضخة الثدي البشري معدلة ويمكن بعد ذلك استخدام الماوس أعرب الحليب لتجارب بحثية أخرى. نحن الآن إثبات آثار الماوس المعرب عنها، والبشرية، ولبن الثدي من معط على نمو وانتشار انتيرويدس المستمدة من الفئران حديثي الولادة أو الأمعاء البشرية سابقا لأوانه.
Introduction
التهاب الأمعاء النّاخر (NEC) هو السبب الرئيسي للوفاة من الأمراض المعوية الخدج، التي تؤثر على ما يقرب من 1 في 10 الرضع المولودين قبل 29 أسبوعا من الحمل1،،من23. نصف الرضع مع تقدم اللجنة الوطنية للانتخابات بشكل أشد، حيث البقاء على قيد الحياة هو فقط 10-30 ٪4،5. في الولايات المتحدة، ما يقدر 2 بیلیون دولار أمريكي سنوياً تنفق علاج الرضع مع اللجنة الوطنية للانتخابات6،7، ولكن معدل البقاء على قيد الحياة ولا العلاج قد تغيرت على مدى السنوات ال 30 الماضية. الآلية المرضية للجنة الوطنية للانتخابات تتميز بإصابة الأمعاء وضعف الأغشية المخاطية الشفاء8،9،10،11، ومع ذلك، مما يشير إلى الممرات المؤدية إلى تفاقم الاستجابة الالتهابية وآليات لعكس الالتهاب ما زالت مفهومة.
إدارة لبن الثدي البشري قد وجد أن تكون استراتيجية وقائية فقط ضد NEC الخدج. وقد أظهرنا سابقا أن لبن الأم يحمي ضد تطوير اللجنة الوطنية للانتخابات عن طريق تثبيط مستقبلات عدد القتلى مثل مستقبلات المناعة الفطرية 4 (TLR4) في ظهارة الأمعاء عن طريق مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) مما يشير إلى مسار11. مكملات حليب الثدي لصيغة تجريبية NEC يخفف الاستجابة الالتهابية في NEC كما يتبين من تثبيط استموات enterocyte وإعادة الانتشار انتيروسيتي بطريقة تعتمد على نمو البشرة EGFR11وعامل (مماثلة). وفي دراسة أخرى، تبين أن النترات، عنصرا آخر من حليب الثدي، ويساهم في طبيعته الواقية من خلال تحوير التروية المعوية، بالمقارنة مع الرضع، التي تفتقر إلى نترات وقد تسهم في زيادة تواتر NEC في صيغة تغذية الرضع12،13. وتشمل المركبات الأخرى الموجودة في لبن الأم التي أظهرت أن تشارك في الحماية ضد لجنة الانتخابات الوطنية oligosaccharides اللبن البشري، ارجينين، الجلوتامين، و lactoferrin14،،من1516، 17،،من1819. هذه العناصر المفيدة من لبن الثدي تكشف عن ضرورة استخدامه في الوقاية من اللجنة الوطنية للانتخابات، ولكن أيضا التشديد على أهمية دراسة الآليات، مما يشير إلى مسارات، والتأثيرات الخلوية تشارك في كيف حليب الثدي هو التوسط للحماية من NEC .
من أجل إجراء مزيد من الدراسة الخصائص الواقية من لبن الثدي في نموذج الفأر من اللجنة الوطنية للانتخابات، قمنا بتطوير تقنية مبتكرة وسهلة الاستخدام عن طريق الماوس التي يمكن استخراج حليب الثدي من سد أنيسثيتيزيد استخدام الثدي البشري كهربائية مضخة11،12 . هذه الاستراتيجية للحصول على حليب الثدي الماوس مفيد، ليس فقط لأن مضخات الثدي البشري متاحة وفعالة في الحصول على حليب الثدي، بل أيضا لأن هذا الأسلوب يسمح بتحليل حليب الثدي إبلاغها. نتيجة لذلك نحن يمكن مقارنة آثار الماوس حليب الثدي حليب الثدي البشري المعرب عنها، فضلا عن المبستر المتبرع البشري الحليب من بنك حليب في نماذج إبلاغها. يسمح هذا الأسلوب لدراسة مكونات لبن الثدي فيما يتعلق بمساهمتها في منع اللجنة الوطنية للانتخابات. غيرها من المحققين قد وضعت أساليب استخراج حليب الثدي، ولكن هذه التقنيات اليدوية، وعادة ما تتطلب أكثر من مختبر الأعضاء20،،من2122. ويرد هنا أسلوب سهل التي يمكن استخدامها بواسطة تعديل مضخة الثدي كهربائية بشرية لجمع الحليب من ماوس. يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية إلى أنواع أخرى.
استجواب الممرات مما يشير إلى المشاركة مع اللجنة الوطنية للانتخابات على نحو كاف، تلزم نظم نموذجية لتقييم جميع أنواع خلايا مختلفة من المعروف أن تتأثر في عملية المرض. هنا، نحن نناقش واحدة مثل هذا النظام النموذجي-انتيرويدس-وإنشائها من الماوس والأمعاء البشرية. انتيرويدس المعوية البشرية (هييس) وبخاصة تقديم وعود كبيرة، لأنها توفر مبتكرة ومتنوعة جينياً السابقين فيفو بشرية نموذجا للمساعدة في دراسة العمليات الفيزيولوجية المرضية التي تحدث في الجهاز الهضمي 23-انتيرويدس تم العثور على أن تكون مثقف طويل الأجل ويمكن أن تجمد ل استخدام لاحق23، وخلافا “البشرية أورجانويدس المعوية” (هيوس)، يتم وضع الذين الثقافات من الخلايا الجذعية pluripotent إيندوسيبلي، يتم إنشاء انتيرويدس من الخلايا الجذعية في24من الخبايا المعوية المعزولة. انتيرويدس تتطلب صيانة أقل، ويمكن أن تكون مصابة بسرعة25، ويمكن أن تنشأ بسهولة نظراً الخبايا المعوية هي أكثر تمايزاً من هيوس23. ولذلك، نقدم هيس العديد من المزايا على التقنيات الموجودة لأنه يمكن تطويرها ليحمل الخصائص التركيبية والوظيفية الخاصة بالمنطقة ل ظهارة المعدة والأمعاء البشرية23. استخدام انتيرويدس خيار فعال للغاية عندما تحتاج إلى نموذج الإنسان من الأمعاء، مع التقيد بالقيود الخاصة بالمنطقة وسهولة الاستخدام. هنا نظهر تقنية عزل والحفاظ على الأولية المستمدة من الخلايا الجذعية الصغيرة الأمعاء انتيرويدس من الفئران والإنسان الخدج.
Protocol
Representative Results
Discussion
ظهارة الأمعاء تتكون من العديد من الأنواع الفرعية الخلوية التي هي مسؤولة عن توفير الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض والمحافظة على سلامة جدار الأمعاء، ويمكن أن تكون خرقت في الآلية المرضية للعديد من الأمراض. بينما نماذج حيوانية ويمكن إيجاز بعض جوانب هذا المرض، النموذج السابقين فيفو انتي…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مغ معتمد من قبل منح K08DK101608 و R03DK111473 من مستشفى المعاهد الوطنية للصحة وآذار/مارس من الدايمات مؤسسة منحة رقم 5-FY17-79، جامعة “معهد واشنطن اكتشاف” الأطفال والأطفال سانت لويس، وإدارة طب الأطفال في جامعة واشنطن مدرسة الطب، سانت لويس. كجل معتمد من قبل R01DK104946 (PI: سيلفرمان)، مستشفى سانت لويس للأطفال وجامعة “معهد واشنطن اكتشاف” الأطفال.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
Referências
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?. Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves’ muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
