Moedermelk verbetert groei van Enteroids: een Ex Vivo Model van celproliferatie
Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe het opzetten van een enteroid cultuur systeem van neonatale muis of voortijdige menselijke darm, alsmede een efficiënte methode voor het verzamelen van melk van muizen.
Abstract
Menselijke kleine intestinale enteroids zijn afgeleid van de crypten en als volwassen in een cel van de stam niche bevatten alle epitheliale celtypen. Het vermogen om menselijke enteroid ex vivo cultuur systemen zijn belangrijk model intestinale pathofysiologie en onderwijs van de betrokken specifieke cellulaire reacties. In de afgelopen jaren worden enteroids van muizen en mensen worden gekweekt, gepasseerd en dwarshelling weg voor toekomstig gebruik in verschillende laboratoria over de hele wereld. Dit enteroid-platform kan worden gebruikt om de effecten van verschillende behandelingen en drugs en wat de gevolgen zijn uitgeoefend op verschillende soorten cellen in de darm te testen. Hier, een protocol voor de vaststelling van primaire stamcel afkomstige kleine intestinale enteroids afgeleid van neonatale muizen en voortijdige menselijke darm wordt verstrekt. Bovendien werd dit enteroid cultuur systeem gebruikt om te testen van de effecten van soortspecifieke moedermelk. Muis moedermelk kan worden verkregen voor het efficiënt gebruik van een gemodificeerde menselijke borst pomp en uitgesproken muis melk kan vervolgens worden gebruikt voor verder onderzoek experimenten. We laten nu zien de gevolgen van uitdrukkelijke muis, menselijke, en donor moedermelk op de groei en de verspreiding van enteroids afgeleid van neonatale muizen of voortijdige menselijke dunne darm.
Introduction
Necrotiserende enterocolitis is (NEC) de belangrijkste doodsoorzaak van gastro-intestinale aandoeningen bij premature zuigelingen, bijna 1 op 10 baby’s geboren vóór 29 weken zwangerschap1,2,3te beïnvloeden. De helft van de zuigelingen met NEC vooruitgang aan de meest ernstige vorm, waar overleven slechts 10-30%4,5 is. In de Verenigde Staten, een geschatte 2-3 miljard USD per jaar zijn uitgegeven behandeling van zuigelingen met NEC6,7, maar noch de therapie de overlevingskans is veranderd in de afgelopen 30 jaar. De pathogenese van NEC wordt gekenmerkt door intestinale letsel en verminderde mucosal helende8,9,10,11, echter de signaalroutes leidt tot een hevige inflammatoire respons en mechanismen om te keren van de ontsteking blijven onvolledig begrepen.
Het beheer van de menselijke moedermelk is gebleken dat de alleen beschermende strategie tegen NEC voor premature zuigelingen. Wij hebben eerder aangetoond dat moedermelk tegen NEC ontwikkeling door remming van het aangeboren immuun receptor toll-like receptor 4 (TLR4) in het intestinaal epitheel via de epidermale groeifactor receptor (EGFR beschermt) signalering traject11. Suppletie van moedermelk naar een experimentele formule van NEC verzwakt de inflammatoire respons in NEC zoals aangetoond door remming van enterocyte apoptosis en herstel van enterocyte proliferatie op een wijze die afhankelijk van epidermale groei was gezien factor (EGF) en EGFR11. In een andere studie, werd aangetoond dat nitraat, een ander onderdeel van moedermelk, draagt bij aan het beschermende karakter door modulerende intestinale perfusie, in vergelijking met zuigelingenvoeding, die ontbreekt nitraat en kan bijdragen aan het verhogen van de frequentie van NEC in formule gevoed zuigelingen12,,13. Andere verbindingen in de moedermelk aanwezig die hebben aangetoond te worden betrokken bij de bescherming tegen NEC bevatten menselijke melk oligosacchariden, L-arginine en glutamine lactoferrine14,15,16, 17,18,19. Deze positieve elementen van moedermelk onthullen de noodzaak van het gebruik ervan in de preventie van NEC, maar ook het belang benadrukken van het bestuderen van de mechanismen, trajecten en cellulaire effecten betrokken in het hoe moedermelk is het bemiddelen van de bescherming tegen NEC-signalering .
Om verdere studie de beschermende eigenschappen van moedermelk in een muismodel van NEC, ontwikkelden we een techniek van het nieuwe, gemakkelijk te gebruiken door welke muis moedermelk kan worden geëxtraheerd uit een narcose dam met behulp van een elektrische menselijke borst pomp11,12 . Deze strategie van het verwerven van muis moedermelk is gunstig, niet alleen omdat de menselijke borst pompen zijn gemakkelijk beschikbaar en efficiënt in de aanschaf van moedermelk, maar ook omdat deze methode voor soortspecifieke borst melk analyses zorgt. Dientengevolge, wij kunt vergelijken met de effecten van muis moedermelk met die van uitgedrukt menselijke moedermelk, evenals gepasteuriseerde melk van de menselijke donor van een bank van de melk in soortspecifieke modellen. Deze techniek maakt het mogelijk voor de studie van de melkbestanddelen van de borst met betrekking tot hun bijdrage aan de preventie van NEC. Andere onderzoekers borst melk extractiemethoden hebben ontwikkeld, maar deze technieken zijn handmatige en vergen doorgaans meer dan één lab lid20,21,22. Hier is een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt door het wijzigen van een menselijke elektrische borstkolf voor het verzamelen van melk van een muis wordt gepresenteerd. Deze techniek kan ook worden toegepast op andere soorten.
Om voldoende ondervragen de signaalroutes betrokken bij NEC, zijn modelsystemen nodig om alle van de verschillende soorten cellen bekend worden beïnvloed in het ziekteproces worden geëvalueerd. Hier bespreken we een dergelijk modelsysteem – enteroids- en de oprichting van de muis en de menselijke dunne darm. Menselijke intestinale enteroids (HIEs) bieden in het bijzonder belangrijke belofte, omdat ze een innovatieve, genetisch divers ex vivo menselijke model bieden als hulpmiddel bij de studie van de pathofysiologische processen die in het maag-darmstelsel plaatsvinden 23. Enteroids bleken te worden gekweekt op lange termijn en kan ingevroren worden voor later gebruik23, en in tegenstelling tot menselijke intestinale Organoids (Spa), wiens culturen zijn ontwikkeld op basis van afleidbare pluripotente stamcellen, enteroids zijn gegenereerd op basis van stamcellen binnen geïsoleerde intestinale crypten24. Enteroids vergen minder onderhoud, kan besmet snel25, en kan gemakkelijk worden vastgesteld aangezien intestinale crypten zijn meer gedifferentieerd dan Oberhof23. Daarom, HIEs bieden veel voordelen ten opzichte van bestaande technieken omdat ze kunnen worden ontwikkeld om de land / regiospecifieke compositorische en functionele eigenschappen van het menselijk gastro-intestinaal epitheel23vertonen. Het gebruik van enteroids is een zeer effectieve keuze wanneer u behoefte aan een menselijke model van de darm, met naleving van de land / regiospecifieke beperkingen en gemak-of-gebruik. Hier tonen we de techniek van het isoleren en onderhouden van primaire stamcel afkomstige kleine intestinale enteroids uit muizen en voortijdige menselijke zuigelingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het intestinaal epitheel bestaat uit vele cellulaire subtypen die verantwoordelijk zijn voor het verstrekken van host afweer tegen ziekteverwekkers, behoud van de integriteit van de barrière van de darm, en in de pathogenese van verschillende ziekten kunnen worden geschonden. Hoewel diermodellen sommige facetten van de ziekte recapituleren kunnen, biedt de ex vivo -model van enteroids die zijn afgeleid van de dunne darm van muizen en mensen een platform om te testen van de effecten van verschillende behandeling…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG wordt ondersteund door subsidies, K08DK101608 en R03DK111473 van de National Institutes of Health, maart van dubbeltjes Stichting Grant No. 5-FY17-79, het Children’s Discovery Institute of Washington University en St. Louis Children’s Hospital en de afdeling Kindergeneeskunde aan de Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL wordt ondersteund door R01DK104946 (PI: Silverman), het Children’s Discovery Institute of Washington University en St. Louis Children’s Hospital.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
Referências
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?. Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves’ muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
