Décellularisation comparable d’Explants de tissu cardiaque foetale et adulte en 3D-comme des plateformes pour les études In Vitro
Summary
La cardiaque matrice extracellulaire (ECM) est un réseau complexe de molécules qui orchestrent des processus clés dans les tissus et organes tout en supportant un remodelage physiologique tout au long de la vie. Décellularisation normalisée de coeur foetal et adultes permet des études expérimentales comparatives des deux tissus dans un contexte 3D en capturant l’architecture native et propriétés biomécaniques.
Abstract
Les connaissances actuelles de la matrice extracellulaire (ECM)-communication cellulaire se traduit par études grand bidimensionnel (2D) in vitro culture où les composantes d’ECM sont présentés comme un revêtement de surface. Ces systèmes de culture constituent une simplification de la complexité du tissu ECM qui englobe la composition biochimique, structure et propriétés mécaniques. Pour mieux imiter la communication ECM-cellule mise en forme du microenvironnement cardiaque, nous avons développé un protocole qui permet la décellularisation du coeur entier foetale et tissu adulte ventricule gauche des explants simultanément pour des études comparatives. Le protocole combine l’utilisation d’un tampon hypotonique, un détergent de propriétés tensioactif anionique et le traitement de la DNase sans aucune exigence de compétences spécialisées ou de l’équipement. L’application de la stratégie de décellularisation même dans des échantillons de tissus provenant de sujets d’âge différents est une autre approche pour effectuer des études comparatives. Le présent protocole permet l’identification des différences structurelles uniques entre foetales et adultes ECM maille et biologique cellulaires réponses cardiaques. En outre, la présente méthodologie illustre une application plus large étant appliquée avec succès dans d’autres tissus et les espèces avec des ajustements mineurs, comme dans les biopsies intestins humains et les poumons de souris.
Introduction
La matrice extracellulaire (ECM) est un réseau dynamique de molécules qui régulent les processus cellulaires importants, à savoir sort-décision, prolifération et la différenciation de1,2. L’enquête des interactions cellule-ECM a été effectuée principalement dans deux dimensions (2D) dans les cultures in vitro recouvert de composantes d’ECM, qui constituent une simplification des propriétés natives de ECM dans vivo. Décellularisation génère acellulaire bioscaffolds ECM de style 3D qui conservent en grande partie l’architecture extracellulaire et la composition des tissus natifs et organes3,4. En plus de servir d’échafaudages bioactifs pour l’ingénierie tissulaire, decellularise biomatériaux 3D de ECM se présentent comme nouvelles plates-formes pour évaluer la biologie cellulaire-ECM qui répliquent l’environnement in vivo.
Évaluation du rôle différentiel des composants ECM de différents tissus, organes et l’âge profiteront avec l’utilisation de protocoles similaires de générer bioscaffolds native. Dans le coeur, nous avons développé un protocole polyvalent pour décellularisation des échantillons foetales et dérivés adulte, comme approche alternative pour effectuer des études comparatives du microenvironnement de l’orgue. En utilisant cette méthode, nous avons capturé le microenvironnement cardiaque natif et a montré que ECM foetale favorise des rendements plus élevés de repeuplement des cellules cardiaques5. Décellularisation fournie également une identification des résidents différences structurelles entre ECM foetale et adulte au niveau du sous-sol lamina et péricellulaire arrangement de maille de matrice et fibre composition5. Avant ce travail, une comparaison entre des tissus à différents stades ontogéniques utilisant la même approche de décellularisation signale seulement pour les reins de singe rhésus et coeurs rongeurs. En outre, un nombre limité d’études rapport de tissus ou d’organes foetaux décellularisation soi5,6,7. Ceci a été réalisé à l’aide de SDS comme un agent unique décellularisation ; Cependant, les concentrations distinctes de SDS étaient utilisées pour la décellularisation du tissu cardiaque foetale et adultes7,8. SDS est l’un des plus efficaces détergents ioniques pour le dédouanement du matériel cytoplasmique et nucléaire et largement utilisé dans la décellularisation de différents tissus et spécimens9,10. Des solutions contenant des concentrations élevées de SDS et longues périodes d’exposition ont été corrélées avec la dénaturation des protéines, la perte de glycosaminoglycanes (gag) et perturbation des fibrilles de collagène10,11et donc une équilibre entre la suppression de préservation et de la cellule ECM est nécessaire. Pour appliquer la même procédure au tissu cardiaque foetale et adulte, le protocole décrit ci-après est divisé en trois étapes successives : la lyse de la cellule par choc osmotique (tampon hypotonique) ; solubilisation des interactions lipides-protéines, ADN-protéine et protéine-protéine (0,2 % SDS) ; et enlèvement de matière nucléaire (traitement de DNase).
Notre protocole présente plusieurs avantages : J’ai) la possibilité de décellularisation équivalente de l’âge des tissus cardiaques par l’application de la stratégie de décellularisation même ; II) pas d’exigences pour les méthodes spécialisées ou de l’équipement ; III) adaptation prête à d’autres tissus et les espèces qu’elle a été appliquée avec succès avec des modifications mineures dans la biopsie intestinale humaine12 et souris poumon13; et, surtout, iv) peut adresser des propriétés biomécaniques ECM tout en permettant à l’Assemblée des cultures de style 3D organotypique qu’imite mieux les caractéristiques moléculaires du microenvironnement tissus natifs.
Protocol
Representative Results
Discussion
La matrice extracellulaire (ECM) est un réseau très dynamique et complex de glycoprotéines fibreuses et adhésifs, composé d’un réservoir de nombreux peptides bioactifs et emprisonné des facteurs de croissance. Comme le modulateur majeur de l’adhésion cellulaire, la dynamique du cytosquelette, motilité/migration, prolifération, différenciation et l’apoptose, ECM régule activement comportement et la fonction cellulaire. Sachant que le comportement cellulaire diffère dans les cultures 2D et 3D, y ont ét?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants à tous les membres du laboratoire de Pinto–Ó pour une discussion critique pertinente. Ce travail a été soutenu par MIT-Fundação Programa para Ciência e Tecnologia (FCT) au titre du projet « CARDIOSTEM-ingénierie des tissus cardiaques et thérapies à base de cellules souches pour des applications cardiovasculaires » (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. est récipiendaire d’une bourse de la CFPI [SFRH/BD/88780/2012] et M.J.O. est un camarade de la CFPI (FCT-détective 2012).
Materials
| Equipment | |||
| Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
| Fluorimeter | – | – | Equipment available |
| Digital weight scale | – | – | Equipment available |
| Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
| Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
| Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
| Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
| Microtome | – | – | Equipment available |
| Cirurgical Instruments | |||
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
| Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
| Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
| Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
| Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
| Materials | |||
| 24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
| 96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
| Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
| Eppendorff | – | – | Material available |
| 15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
| Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
| Tissue cryopreservation | |||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
| 2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
| Dry ice | – | – | – |
| Decellularization | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
| TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
| MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
| DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
| Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Histology | |||
| 10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
| Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
| Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
| Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
| Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
| Cell culture | |||
| DPBS | VWR | 45000-434 | – |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |
Referências
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