시험관 연구에 대 한 3D 같은 플랫폼으로 태아와 성인 심장 조직 Explants의 비교 Decellularization
Summary
심장 세포 외 기질 (ECM) 생활 내내 개장 하는 생리 적 지속 하는 동안 조직 및 장기에서 핵심 프로세스를 조정 하는 분자의 복잡 한 네트워크입니다. 태아 및 성인 심 혼의 표준된 decellularization는 네이티브 아키텍처 및 biomechanical 속성을 포착 하 여 3D 컨텍스트에서 두 조직의 비교 실험 연구를 허용 합니다.
Abstract
세포 외 기질 (ECM)의 현재 정보-셀 통신 변환 큰 2 차원 (2D) 생체 외에서 문화 연구 ECM 구성 요소 표면 코팅으로 표시 됩니다. 이러한 문화 시스템 구성 조직 구조, 생 화 확 적인 구성과 기계적 특성을 포함 하는 ECM의 복잡 한 자연의 단순화. 더 나은 심장 microenvironment를 형성 하는 ECM 셀 통신 에뮬레이션, 우리 전체 태아 심장의 decellularization에 대 한 허용 하는 프로토콜을 개발 하 고 성인 좌 심 실 조직 explants 비교 연구에 대 한 동시에. 프로토콜 전문된 기술 이나 장비에 대 한 소형 버퍼, 음이온 계면 활성 제 속성, 그리고 어떤 요구 사항 없이 DNase 처리의 세제를 사용 하 여를 결합합니다. 다양 한 나이의 과목에서 조직 샘플에서 동일한 decellularization 전략의 응용 프로그램은 비교 연구를 수행 하는 대체 접근 이다. 현재 의정서 태아 및 성인 심장 ECM 메쉬 및 생물 세포 응답에 걸쳐 독특한 구조 차이 식별을 허용 한다. 또한,는 여기 방법론 성공적으로 적용 되 다른 조직 및 사소한 조정 종에와 같은 인간의 내장 biopsies을 마우스 폐에 광범위 한 응용 프로그램을 보여 줍니다.
Introduction
세포 외 기질 (ECM) 중요 한 세포질 과정, 즉 운명 결정, 확산 및 감 별 법1,2를 조절 하는 분자의 동적 네트워크입니다. 세포-ECM 상호 작용의 조사는 비보에네이티브 ECM 속성의 단순화 구성 2 차원 (2D) ECM 구성 요소와 코팅 생체 외 문화에서에서 주로 수행 되었습니다. Decellularization 세포 외 건축과 네이티브 조직 및 장기3,4의 크게 보존 acellular 3D 같은 ECM bioscaffolds를 생성 합니다. 조직 공학에 대 한 생리 활성 공중 발판으로 봉사 이외에 decellularized 3D ECM 생체는 그 병렬 vivo에서 환경 생물학 세포-ECM을 평가 하기 위해 새로운 플랫폼으로 등장 하고있다.
뚜렷한 조직, 기관 및 나이의 ECM 구성 요소의 차동 역할의 평가 네이티브 bioscaffolds 생성의 유사한 프로토콜의 사용으로 도움이 됩니다. 마음에 우리 기관 microenvironment의 비교 연구를 수행 하는 대체 접근 방식으로 태아와 성인 파생 된 샘플의 decellularization에 대 한 다양 한 프로토콜을 개발 했습니다. 이 방법론을 사용 하 여, 우리는 네이티브 심장 microenvironment를 점령 하 고 태아 ECM 심장 세포5의 더 높은 repopulation 수익률을 촉진 했다. Decellularization는 더 거주 구조와의 차이점 지하실 lamina 및 pericellular 매트릭스 메쉬 배열 수준에서 태아 및 성인 ECM 섬유 구성5식별 제공. 이 작품 전에 동일한 decellularization 접근을 사용 하 여 다른 ontogenic 단계에서 조직의 머리 비교만 붉은 털 원숭이 신장 및 설치류 마음 보고 되었습니다. 또한, 제한 된 수의 연구 보고서 태아 조직/기관 decellularization se 당5,,67. 이 독특한 decellularization 에이전트로; SDS를 사용 하 여 달성 되었습니다. 그러나, 뚜렷한 SDS 농도 태아와 성인 심장 조직7,8decellularization 위해 사용 되었다. SDS 세포질 및 핵 자료의 정리에 대 한 가장 효과적인 이온 세제 중 하나 이며 다른 조직 및 표본9,10decellularization에서 널리 이용 된다. 높은 SDS 농도 노출의 연장된 기간을 포함 하는 솔루션은 단백질 변성, glycosaminoglycan (개 그) 감소와 콜라겐 소10,11의 상관 되었다 있다 따라서는 ECM 보존 및 셀 제거 사이의 균형은 필요 합니다. 태아 및 성인 심장 조직에 동일한 절차를 적용 하려면 여기에 설명 된 프로토콜 3 순차적 단계에서 나누어져: 삼투성 충격 (소형 버퍼); 세포를 세포 지질 단백질, DNA-단백질 및 단백질 단백질 상호 작용 (0.2 %SDS);의 가용 화 그리고 핵 재료 제거 (DNase 치료)입니다.
우리의 프로토콜 몇 가지 장점을 보여줍니다: 내가) 나이 특정 심장 조직의 동일한 decellularization 전략; 응용 프로그램에 의해 동등한 decellularization의 가능성 특수 방법이 나 장비에 대 한 ii) 요구 사항 iii)로 인간의 내장 biopsies12 와 마우스 폐13;에서 사소한 변경으로 성공적으로 적용 된 다른 조직 및 종 적응 준비 그리고, 중요 한 것은, iv) 더 밀접 하 게 기본 조직 microenvironment의 분자 기능을 모방 하는 3D와 같은 organotypic 문화의 어셈블리를 사용 하는 동안 ECM biomechanical 속성을 해결할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포 외 기질 (ECM) 수많은 생리 활성 펩 티 드 및 성장 요인 내포의 저수지로 구성 된 섬유와 접착제 glycoproteins의 매우 역동적이 고 복잡 한 채널 이다. 세포 접착, 골격 역학, 운동 성/마이그레이션, 확산, 감 별 법, apoptosis의 주요 변조기로 ECM 적극적으로 세포 기능 및 행동을 통제 한다. 세포질 행동 2D와 3D 문화에서 차이가 알면, 있었다 정확 하 게 자연 조직 환경을 복제할 수 소설 organotypic 모델을 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 관련 중요 한 토론에 대 한 핀 토-마-Ó 연구소의 모든 구성원에 게 빚을. 이 작품 프로젝트 “CARDIOSTEM 설계 심장 조직 및 심장 혈관 응용 프로그램에 대 한 줄기 세포 기반 요법” 아래 프로그램이 MIT Fundação 파라 과학 전자 기술 (FCT)에 의해 지원 되었다 (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. [SFRH/BD/88780/2012] FCT 화목의 받는 사람 이며 M.J.O.은 FCT 동료 (FCT 탐정 2012).
Materials
| Equipment | |||
| Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
| Fluorimeter | – | – | Equipment available |
| Digital weight scale | – | – | Equipment available |
| Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
| Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
| Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
| Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
| Microtome | – | – | Equipment available |
| Cirurgical Instruments | |||
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
| Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
| Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
| Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
| Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
| Materials | |||
| 24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
| 96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
| Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
| Eppendorff | – | – | Material available |
| 15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
| Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
| Tissue cryopreservation | |||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
| 2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
| Dry ice | – | – | – |
| Decellularization | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
| TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
| MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
| DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
| Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Histology | |||
| 10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
| Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
| Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
| Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
| Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
| Cell culture | |||
| DPBS | VWR | 45000-434 | – |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |
Referências
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