Vergleichbare Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe Explantaten als 3D-ähnliche Plattformen für In-vitro-Studien
Summary
Die kardiale extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Netzwerk von Molekülen, die Schlüsselprozesse in Geweben und Organen zu orchestrieren, während dauerhafte physiologische Umbau lebenslang. Standardisierte Decellularization der fetalen und adulten Herzen ermöglicht vergleichende experimentelle Studien der beiden Gewebe in einem 3D Kontext durch die Erfassung von native Architektur und biomechanischen Eigenschaften.
Abstract
Aktuelle Kenntnisse der extrazellulären Matrix (ECM)-Zell-Kommunikation führt zu großen zweidimensionalen (2D) in-vitro-Kultur Studien wo ECM-Komponenten als eine Oberflächenbeschichtung präsentiert werden. Diese Kultur-Systeme bilden eine Vereinfachung der komplexen Natur des Gewebes ECM, die biochemische Zusammensetzung, Struktur und mechanischen Eigenschaften umfasst. Um die Gestaltung der kardialen Mikroumgebung ECM-Zell-Kommunikation besser zu emulieren, entwickelten wir ein Protokoll, das für die Decellularization des gesamten fetalen Herzens ermöglicht und Erwachsenen linke Herzkammer Gewebe explants gleichzeitig für vergleichende Studien. Das Protokoll kombiniert die Verwendung von hypotone Puffer, ein Waschmittel von anionischen Tensiden Eigenschaften und DNase-Behandlung, ohne spezielle Fähigkeiten oder Ausrüstung. Die Anwendung der gleichen Decellularization Strategie in Gewebeproben von Themen der unterschiedlichen Alters ist ein alternativer Ansatz zur vergleichende Studien durchführen. Dieses Protokoll ermöglicht die Identifikation von einzigartigen strukturelle Unterschiede in fetalen und adulten kardiale ECM Mesh und biologische zelluläre Reaktionen. Darüber hinaus die hierin Methodik zeigt eine breitere Anwendung erfolgreich in anderen Geweben und Arten mit kleineren Anpassungen, wie z. B. im menschlichen Darm Biopsien und Maus Lungenkrebs angewendet.
Introduction
Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein dynamisches Netzwerk von Molekülen, die wichtige zelluläre Prozesse, nämlich Schicksal-Entscheidung, Proliferation und Differenzierung1,2zu regulieren. Die Untersuchung der Zelle-ECM Interaktionen trat hauptsächlich in zweidimensionale (2D) in-vitro-Kulturen beschichtet mit ECM-Komponenten, die darstellen, einer Vereinfachung der native ECM Unterkünfte gefunden in Vivo. Decellularization erzeugt azellulärer 3D-wie ECM-Bioscaffolds, die die extrazelluläre Architektur und Zusammensetzung des nativen Gewebe und Organe3,4weitgehend zu bewahren. Neben seiner Tätigkeit als bioaktive Scaffolds für das Tissue Engineering, entstehen decellularized 3D ECM Biomaterialien als neuartige Plattformen Zelle-ECM Biologie zu bewerten, dass Parallel der in-vivo-Umgebung.
Bewertung der differenziellen Rolle der ECM-Komponenten unterschiedliche Gewebe, Organe und Alter profitieren mit dem Einsatz von ähnliche Protokolle native Bioscaffolds zu erzeugen. Im Herzen entwickelten wir ein vielseitiges Protokoll für Decellularization der fetalen und Erwachsenen stammenden Proben als ein alternativer Ansatz zur vergleichende Studien über die Orgel Mikroumgebung durchführen. Mit dieser Methodik, wir erfasst die native kardiale Mikroumgebung und zeigte, dass fetale ECM Wiederbesiedlung Mehrertrag von Herzzellen5fördert. Decellularization legte weitere Identifizierung ansässigen struktureller Unterschiede zwischen embryonalen und adulten ECM auf der Ebene der Keller Lamina und Pericellular Matrix-Netz-Anordnung und Faser Zusammensetzung5. Vor dieser Arbeit wurde Direktvergleich der Gewebe in den verschiedenen ontogenic Phasen mit dem gleichen Decellularization Ansatz nur für Rhesus-Affen Nieren und Nagetier Herzen berichtet. Eine begrenzte Anzahl von Studien berichten darüber hinaus fetalen Gewebe/Organ Decellularization per se5,6,7. Dies wurde erreicht mit SDS als einen einzigartigen Decellularization-Agent; Allerdings dienten verschiedene SDS-Konzentrationen für die Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe7,8. SDS ist eines der effektivsten Ionischen Reinigungsmittel für die Abfertigung der zytoplasmatischen und nuklearem Material, und am meisten benutzt in den Decellularization der verschiedenen Gewebe und Proben9,10. Lösungen mit hohen Konzentrationen von SDS und längere Exposition wurde mit Protein-Denaturierung, Glykosaminoglykan (GAGs) Verlust und Störung der Kollagen Fibrillen10,11, korreliert und somit eine Gleichgewicht zwischen Erhaltung und Zelle entfernen ECM ist notwendig. Um das gleiche Verfahren auf fetalen und adulten Herzgewebe anzuwenden, das Protokoll beschriebenen gliedert sich in drei aufeinander folgenden Schritten: Zell-Lyse durch osmotischen Schock (hypotone Puffer); Solubilisierung von Lipid-Protein und DNA-Protein-Protein-Protein Interaktionen (0,2 % SDS); und nuklearen Materialabtrag (DNase-Behandlung).
Unser Protokoll zeigt mehrere Vorteile: ich) die Möglichkeit, gleichwertige Decellularization der altersspezifischen kardialen Gewebe durch die Anwendung der gleichen Decellularization-Strategie; (II) keine Anforderungen für spezielle Methoden oder Geräte; (III) Anpassung an andere Gewebe und Arten bereit, wie sie erfolgreich mit geringfügigen Änderungen im menschlichen Darm Biopsien12 und Maus Lunge13angewendet wurde; und vor allem iv) ECM biomechanische Eigenschaften und ermöglicht die Montage von 3D-ähnliche organotypischen Kulturen, dass mehr genau die molekularen Eigenschaften der nativen Gewebe Mikroumgebung imitieren ansprechen können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein äußerst dynamischen und komplexen Geflecht von faserigen und Klebstoff Glykoproteinen, bestehend aus einem Reservoir von zahlreichen bioaktiven Peptiden und eingeschlossene Wachstumsfaktoren. Als die wichtigsten Modulator der Zelladhäsion, Zytoskelett Dynamik, Motilität/Migration, Proliferation, Differenzierung und Apoptose regelt ECM aktiv Zellfunktion und Verhalten. Zu wissen, dass zelluläre Verhalten in 2D und 3D Kulturen unterscheidet, wurden Anstrengungen unternommen, ne…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind verpflichtet, alle Mitglieder der Pinto Ó Labor für relevante kritische Diskussion. Diese Arbeit wurde unterstützt von Programa MIT-Fundação Para Ciência e Tecnologia (FCT) im Rahmen des Projekts “CARDIOSTEM-Engineered kardialen Gewebe und stammzellbasierte Therapien für Herz-Kreislauf-Anwendungen” (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S ist ein FCT Fellow [SFRH/BD/88780/2012] und M.J.O. ist FCT Fellow (FCT-Investigator 2012).
Materials
| Equipment | |||
| Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
| Fluorimeter | – | – | Equipment available |
| Digital weight scale | – | – | Equipment available |
| Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
| Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
| Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
| Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
| Microtome | – | – | Equipment available |
| Cirurgical Instruments | |||
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
| Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
| Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
| Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
| Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
| Materials | |||
| 24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
| 96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
| Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
| Eppendorff | – | – | Material available |
| 15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
| Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
| Tissue cryopreservation | |||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
| 2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
| Dry ice | – | – | – |
| Decellularization | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
| TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
| MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
| DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
| Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Histology | |||
| 10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
| Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
| Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
| Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
| Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
| Cell culture | |||
| DPBS | VWR | 45000-434 | – |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |
Referências
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