Reazioni a cascata enzimatica per la sintesi di Amino alcoli chirali da L-lisina
Summary
Amino alcoli chirali sono molecole versatili per l’utilizzo come scaffold in sintesi organica. A partire da L-lisina, sintetizziamo amino alcoli da una reazione a cascata enzimatica combinando diastereoselettiva C-H ossidazione catalizzata da diossigenasi seguita dalla scissione della parte dell’acido carbossilico dell’amminoacido corrispondente dell’idrossile di un decarbossilasi.
Abstract
Amino alcoli sono composti versatili con una vasta gamma di applicazioni. Per esempio, essi sono stati usati come impalcature chirali in sintesi organica. Loro sintesi di chimica organica convenzionale spesso richiedono processi di noioso sintesi multi-step, con controllo difficile del risultato stereochemical. Vi presentiamo un protocollo per sintetizzare enzimaticamente amino alcoli a partire dalla L-lisina prontamente disponibile in 48 h. Questo protocollo combina due reazioni chimiche che sono molto difficili da condurre di sintesi organica convenzionali. Nel primo passaggio, il regio – e diastereoselettiva ossidazione di un legame C-H unactivated della lisina catena laterale è catalizzata da un dioxygenase; un secondo regio – e diastereoselettiva ossidazione catalizzata da un dioxygenase di regiodivergent può portare alla formazione di 1,2-dioli. Nell’ultimo passaggio, il gruppo carbossilico dell’amminoacido alfa viene scisso da una decarbossilasi del fosfato del piradossale (PLP) (DC). Questo passaggio decarboxylative riguarda solo il carbonio alfa dell’amminoacido, mantenendo il centro stereogenico idrossi-sostituiti in posizione beta/gamma. La risultante amino alcoli otticamente sono pertanto arricchiti. Il protocollo è stato applicato con successo alla sintesi semipreparative-scala di quattro amino alcoli. Monitoraggio delle reazioni è stata condotta mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) dopo derivatizzazione di 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Semplice purificazione di estrazione in fase solida (SPE) conferita la amino alcoli con ottimi rendimenti (93% di > 95%).
Introduction
Nonostante i vantaggi offerti da biocatalisi, l’integrazione di biocatalitici passi nelle vie sintetiche o rotte biocatalitici totale rimane per lo più limitata a risoluzioni di cinetiche enzimatiche. Questi percorsi sono stati ampiamente utilizzati come un primo passo nella sintesi asimmetrica chemo-enzimatica, ma biocatalisi offre molte più possibilità nel gruppo funzionale interconversioni con elevata stereoselettività1,2,3 . Inoltre, come reazioni biocatalitici sono condotte in condizioni simili, pertanto è possibile eseguire reazioni a cascata della moda uno-pentola4,5.
Amino alcoli chirali sono molecole versatili per l’utilizzo come ausiliari o impalcature in sintesi organica6. La frazione di alcool amminico è trovata frequentemente in metaboliti secondari e ingredienti farmaceutici attivi (API). Alcoli primari β-amminici sono prontamente disponibili dagli acidi α-amminici corrispondenti di sintesi chimica convenzionale, ma l’accesso a γ-amino alcoli chirali o amminoalcoli secondari richiede spesso noiose vie sintetiche insieme sensibile controllo della stereochimica7,8,9,10. A causa della sua elevata stereoselettività, biocatalisi possono fornire un percorso sintetico superiore a questi blocchi chirali11,12,13,14.
Precedentemente abbiamo segnalato la sintesi di mono – e di-idrossi-L-lisine di diastereoselettiva idrossilazione enzimatica catalizzata da diossigenasi del ferro (II) / α-chetoacido-dipendente famiglia ossigenasi (αKAO) (Figura 1)15. In particolare, a partire da L-lisina, la KDO1 dioxygenase catalizza la formazione di (3S) – derivato idrossilato (1), mentre il (4R) – derivato (2) è costituito dalla reazione con KDO2 diossigenasi. Regiodivergent successivi idrossilazioni da KDO1 e KDO2 portano alla formazione dei (3R, 4R) – diidrossi – L-lisina (3) in forma otticamente puro. Tuttavia, la gamma limitata di substrato di questi enzimi impedisce loro ampio utilizzo in sintesi chimica, soprattutto nell’idrossilazione di ammine semplici, come una molecola di acido carbossilico nella α-posizione del gruppo amminico è essenziale per attività16.
Figura 1: biocatalitici conversioni di L-lisina. Conversione in (3S) – idrossi – L-lisina (1) catalizzata da KDO1 dioxygenase; (4R) – idrossi – L-lisina (2) catalizzata da KDO2 dioxygenase; e (3R, 4R) – diidrossi – L-lisina (3) da reazione a cascata catalizzata successivamente da KDO1 e KDO2 diossigenasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Decarbossilazione è una reazione comune nel metabolismo17. In particolare, dell’amminoacido DCs (EC 4.1.1) sono privo di cofattore (piruvoil-dipendente) o enzimi PLP-dipendenti e catalizzano la decarbossilazione degli aminoacidi nelle poliammine corrispondente in batteri e più alti organismi18,19 , 20 , 21 , 22. la mono – diidrossi composti (Figura 3) 4–7, 10–11 corrispondono ai idrossilati cadaverina, diammina ottenuta mediante decarbossilazione della L-lisina. La cadaverina è un elemento chiave per l’industria chimica, in particolare è un componente di polimeri in poliammide e poliuretano. Di conseguenza, produzione biologica di questo diammina da risorse rinnovabili ha attirato l’attenzione come un’alternativa al percorso a base di petrolio, e vari microrganismi sono stati progettati per questo scopo. In queste vie metaboliche, lisina DC (LDC) è l’enzima chiave. LDC è un enzima di PLP-dipendenti appartenenti al alanina racemasi (AR) strutturali famiglia23. I controller di dominio di PLP-dipendenti (PLP-DCs) sono noti per essere altamente substrato specifico. Tuttavia, alcuni enzimi proprio la capacità di promiscuità leggera, essendo attivo verso gli aminoacidi L-ornitina e la L-lisina, come ad esempio la LDC da Selenomonas rumirantium (LDCSrum), che ha simili costanti cinetiche per lisina e ornitina decarbossilazione24,25. Questo substrato esteso specificità rende questo enzima un buon candidato per la decarbossilazione di mono – e di-idrossi-L-lisina. Inoltre, per trovare DCs attivo verso i derivati dell’idrossile di lisina, abbiamo esaminato il contesto genomico dei geni che codificano gli enzimi αKAO. Infatti, nei genomi procariotici i geni che codificano per enzimi coinvolti nella via biosintetica del stessa generalmente sono co-localizzati in cluster genici. Il gene KDO2 (da Chitinophaga pinensis) è stato trovato co-localizzato con un gene che codifica per presunti PLP-DC (Figura 2). Al contrario, nessun gene che codifica per la DC è stato trovato quando si analizza il contesto genomico di dioxygenase del KDO1. La proteina PLP-DC da c. pinensis (DCCpin) pertanto è stata selezionata come candidato promising per catalizzare il passo di decarbossilazione della reazione cascade.
Figura 2: contesto Genomic del gene KDO2 in c. pinensis. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Di conseguenza, abbiamo progettato reazioni cascata enzimatica che coinvolgono diossigenasi e DCs per realizzare la sintesi di alcoli alifatici chirali β e γ-amminico da amminoacidi (Figura 3). Come precedentemente segnalato, l’ossidazione di C-H catalizzata dalla αKAO introduce il centro stereogenico idrossi-sostituiti con totale diastereoselettività; la chiralità Cβ/γ verrà mantenuta nel passaggio decarboxylative, che colpisce solo il carbonio Cα della molecola dell’amminoacido16.
Figura 3: analisi retrosintetica. (A) Retrosynthesis di β e γ-amino alcoli (R) – 1,5 – diaminopentan-2-olo (4) da (5R) – idrossi – L-lisina e diaminopentan (S) – 1,5–2-ol (5) e 1,5-diaminopentan-3-ol (6) da L-lisina. (B) Retrosynthesis di β, γ e β, δ-amino dioli (2S, 3S) – 1,5 – diaminopentane-2,3-diolo (10) e (2R, 4S) – 1,5 – diaminopentane-2,4-diolo (11) a partire da (5R)- idrossi-L-lisina e (2R, 3R) – 1,5 – diaminopentane-2,3-diolo (7) a partire da L-lisina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
A partire da L-lisina e i suoi (5R)-derivato idrossilato, qui segnaliamo un due/tre step, una pentola, procedura enzimatica che unisce diossigenasi e PLP-DCs per ottenere l’obiettivo amino alcoli. Prima la sintesi a scala di laboratorio delle molecole bersaglio, il metodo è stato sviluppato presso la scala analitica per regolare le condizioni di reazione, ad esempio, le concentrazioni di enzimi, necessari per consentire la conversione completa dei materiali di partenza; Presentiamo questa procedura pure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Derivati e amino alcoli chirali hanno una vasta gamma di applicazioni, da ausiliari chirali per la sintesi organica di terapia farmaceutica. Multistep sintesi per la produzione di alcoli aminoacidi di sintesi organica convenzionali sono numerose, ma potrebbe non essere sempre efficiente a causa di passaggi noioso protezione/deprotezione insieme con un sensibile controllo della stereochimica16. Un approccio biocatalitico che eroga con le operazioni di protezione/deprotezione ed è solitamente altam…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Véronique de Berardinis per la proficua discussione e Alain Perret, Christine Pellé e Peggy Sirvain per il supporto tecnico.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma Aldrich | L5626 | |
| (5S)-hydroxy-L-lysine | Sigma Aldrich | GPS NONH | Out sourcing |
| α-ketoglutaric acid | Sigma Aldrich | 75892 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate | Acros | 201370250 | |
| Pyridoxal phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | 82870 | |
| 3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | |
| 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Sigma Aldrich | D1529 | |
| Ethanol | VWR | 20825.290 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 71631 | |
| HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
| HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
| Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83640.320 | |
| 2,2,2-trifluoroacetic acid | VWR | 153112E | |
| Ammonia 28% | VWR | 21182.294 | |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83638.32 | |
| Formic acid | Acros | 270480010 | |
| Phosphoric acid 85% | Acros | 201145000 | |
| Deuterium oxide | Acros | 320,710,075 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| C18 HPLC column | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
| Accela UHPLC System | ThermoFisher Scientific | ||
| Accela PDA detector | ThermoFisher Scientific | ||
| 4mm syringe filters – 0,22µm – PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
| Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip | VWR | HSWA5010.200V0 | |
| Cation exchange resin 100-200 mesh | Sigma Aldrich | 217506 | |
| Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL | Waters | 186000776 | |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | |
| Rotary evaporator | Büchi | 531-0103 | |
| Lyophilizer alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
| Micropipette 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
| Micropipette 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
| Micropipette 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
| Micropipette 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
| 300 MHz spectrometer | Bruker | ||
| 2 mL microtube | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tube | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
| 25 mL round-bottom flask 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
| 100 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL erlenmeyer flask | Fischerbrand | 15496143 |
Referências
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