Méthodes pour la mise en scène des périodes nymphale et mesure de Pigmentation de l’aile de Drosophila guttifera
Summary
Protocoles pour la stadification des périodes nymphales et mesure de la pigmentation de la voilure de Drosophila guttifera sont décrits. Mise en scène et la quantification de la pigmentation fournissent une base solide pour l’étude des mécanismes de développement des traits adultes et permettent la comparaison interspécifique de développement de caractère.
Abstract
Diversifié d’espèces de drosophile (mouche) offrent des possibilités d’étudier les mécanismes du développement et des modifications génétiques responsables des changements évolutifs. En particulier, le stade adulte est une source riche des traits morphologiques pour comparaison interspécifique, y compris la comparaison de pigmentation aile. Afin d’étudier les différences de développement entre les espèces, observation détaillée et mise en scène appropriée sont nécessaires pour comparaison précise. Nous décrivons ici les protocoles de mise en scène des périodes nymphales et quantification de la pigmentation chez un pois drosophile, Drosophila guttiferaaile. Tout d’abord, nous décrivons la méthode d’observation morphologique détaillée et définition des stades nymphales issu des morphologies. Cette méthode comprend une technique pour enlever le puparium, qui est le cas de chitineux externe de la chrysalide, pour permettre l’observation détaillée des morphologies pupes. En second lieu, nous décrivons la méthode pour mesurer la durée des stades nymphales définis. Enfin, nous décrivons la méthode pour la quantification de la pigmentation Escadre basée sur l’analyse d’images à l’aide d’images numériques et logiciels ImageJ. Avec ces méthodes, nous pouvons établir une base solide pour la comparaison des processus de développement des traits adultes stades nymphales.
Introduction
Certains des traits morphologiques de la drosophile sont diversifié en fonction des espèces1,2,3,4,5. Nous pouvons aborder la question de la diversité morphologique comment se pose en comparant les mécanismes de génération de ces morphologies. Trichomes larvaires, peignes de sexe adulte, appareil génital externe, pigmentation cutanée abdominale et aile pigmentation6,7,8,9, sont des exemples de ces morphologies 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. afin d’étudier les différences morphologiques entre les adultes, observation et analyse des stades nymphales sont importantes, car le sort des traits adultes est déterminé dans les derniers stades larvaires et morphogenèse ultérieure procède au cours de la période nymphale.
Dans des études de biologie du développement de Drosophila melanogaster, « heures CSA » (heures après la formation de la pupe) est la méthode couramment utilisée pour indiquer une chrysalide16. Ce système emploie temps absolu après formation de la pupe et est très pratique pour des expériences courantes. Cependant, vitesse du développement peut-être différer chez les nymphes et peut être affectée par légères différences génétiques, épigénétiques ou micro-environnementales, et par conséquent avoir le même temps absolu après formation de la pupe ne garantit pas que les nymphes sont dans le même stade de développement. Dans de nombreux cas, les étapes définies par les caractéristiques morphologiques sont préférables pour comparer plusieurs personnes. En particulier, une comparaison entre les espèces nécessite mise en scène précise et comparaison entre les étapes (homologues) correspondantes.
Bainbridge et Bownes17 reconnu 20 stades nymphales (P1 à P15(ii)) basé sur des caractéristiques morphologiques des pupes de Drosophila melanogaster . Cette mise en scène est le plus largement utilisé de la mise en scène du développement morphologique18. Dans une étude précédente, nous avons effectué pupal mise en scène de Drosophila guttifera pour établir une base pour aile pigmentation études19. D. guttifera a pois noir sur ses ailes et est l’un de l’espèce modèle pour aile pigmentation formation20. Bien que nous avons évoqué les critères morphologiques décrits dans le Bainbridge et ‘Bownes recherche17, nous avons mesuré directement durées étape par observations série19, au lieu d’utiliser Bainbridge et Bownes’ estimation de la durée de l’étape de la fréquence observée. Nous décrivons ici la méthode de mise en scène pupe et de mesure des durées des stades nymphales de Drosophila utilisé dans Fukutomi et al.,19.
Pour étudier le mécanisme du développement de la pigmentation de l’aile, nous avons besoin de savoir quand les stades nymphales ou adultes la pigmentation se produit. Fukutomi et al. 19 quantifiée des densités optiques (ODs) de pigmentation stades nymphal et adulte par analyse d’image des images de l’aile. La pigmentation des ailes de la drosophile est pensée pour être causée par une accumulation de mélanine noire21. Pour la quantification de ces substances, échelle de gris des images et ImageJ logiciel (https://imagej.nih.gov/ij/)22 ont été utilisés. Pour reconnaître et quantifier la pigmentation spot spécifique (ΔOD), nous soustrayons l’OD en dehors d’une place de la Division d’opposition à l’intérieur d’un spot. Pour rendre cette méthode objective et reproductible, les lieux de mesure OD doivent être déterminées en utilisant des veines de l’aile comme points de repère. Dans cet article, nous décrivons en détail cette méthode de dosage de la pigmentation de la voilure dans drosophile guttifera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici les protocoles pour la définition des étapes pupes, enlevant le puparium pour l’observation détaillée, mesure des durées des stades nymphales et mesure de l’intensité des taches noires sur une aile dans d. guttifera. Ces protocoles peuvent être appliquées pour les nombreux Drosophila et des espèces, en particulier les espèces avec la pigmentation de l’aile.
Observation approfondie et une description plus détaillées des événements du dé…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Sean B. Carroll et Thomas Werner pour fournir des stocks de mouche, Naoyuki fusible pour l’équipement, Byung Seok Jin pour son aide dans le tournage, Kiyokazu Agata de mentorat et Elizabeth Nakajima pour l’édition anglaise. Ce travail a été soutenu par KAKENHI 17K 19427 et Takeda (FNS).
Materials
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits – C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits – C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 – 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
Referências
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