שיטות מדידה של אגף פיגמנטציה של דרוזופילה guttifera ותקופות הגולמי הזמני
Summary
פרוטוקולים עבור היערכות תקופות הגולמי ומדידה של אגף פיגמנטציה של דרוזופילה guttifera מתוארים. האחסון הזמני, כימות של פיגמנטציה לספק בסיס מוצק לימוד מנגנוני התפתחותית של תכונות למבוגרים ולאפשר השוואה interspecific של תכונה הפיתוח.
Abstract
מגוונת מיני דרוזופילה (זבוב הפירות) מספקים הזדמנויות ללמוד מנגנונים של פיתוח, שינויים גנטיים אחראים שינויים אבולוציוניים. בפרט, השלב למבוגרים הוא מקור עשיר של תכונות מורפולוגיות להשוואה interspecific, כולל השוואה פיגמנטציה כנף. במחקר התפתחותי הבדלים בין המינים, התבוננות מפורטת ובימוי המתאים נדרשים עבור השוואה מדויקת. כאן נתאר פרוטוקולים הזמני של תקופות הגולמי, כימות של אגף פיגמנטציה של זבוב פירות מנוקד, guttifera דרוזופילה. ראשית, אנו מתארים את שיטת עבור ההגדרה של שלבים הגולמי בהתבסס על מורפולוגיות ופיקוח מורפולוגי מפורט. שיטה זו כוללת טכניקה עבור הסרת את puparium, כמו במקרה chitinous החיצוני של הגולם, כדי לאפשר התבוננות מפורטת מורפולוגיות הגולמי. שנית, אנו מתארים שיטה למדידת משך שלבים מוגדרים הגולמי. לבסוף, אנו מתארים את השיטה על כימות של פיגמנטציה כנף בהתבסס על ניתוח התמונה באמצעות תמונות דיגיטליות ותוכנה ImageJ. באמצעות שיטות אלה, אנו יכולים להקים בסיס מוצק להשוואת תהליכים התפתחותיים של תכונות למבוגרים בשלבים הגולמי.
Introduction
חלק תכונות מורפולוגיות דרוזופילה מגוונים בין המינים1,2,3,4,5. עלינו לגשת לשאלה של גיוון איך מורפולוגי נשאלת על ידי השוואת את המנגנונים של דור מורפולוגיות אלה. דוגמאות כאלה מורפולוגיות הם trichomes זחל, מסרקים המין למבוגרים, המנגנון איברי המין החיצוניים, פיגמנטציה בטן ואגף פיגמנטציה6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. ללמוד הבדלים מורפולוגיים בין מבוגרים, התבוננות וניתוח של השלבים הגולמי הם חשובים, כי גורלו של תכונות למבוגרים נקבע לפי הזחל מאוחר וממשיך מורפוגנזה הבאים במהלך תקופת הגולמי.
בלימודי ביולוגיה התפתחותית דרוזופילה melanogaster, “שעות APF” (שעות לאחר היווצרות הגולמי) היא השיטה הנפוצה כדי לציין גולמי16. מערכת זו מעסיקה זמן מוחלט לאחר היווצרות הגולמי, והוא מאוד נוח עבור ניסויים שגרתית. עם זאת, מהירות התפתחותי עשויים להיות שונים בין הגלמים, עשוי להיות מושפע הבדל גנטי, epigenetic או microenvironmental ואת ולכן נתקל באותו זמן מוחלט לאחר היווצרות הגולמי אינה מבטיחה כי הגלמים הם באותו שלב התפתחותי. במקרים רבים, שלבים מוגדרים על-ידי תכונות מורפולוגיות עדיפים להשוואת בכמה אנשים. במיוחד, השוואה בין מינים דורש היערכות מדויק השוואה בין שלבים (הומולוגיים) המתאים.
Bainbridge ו- Bownes17 מוכר 20 שלבים הגולמי (P1 כדי P15(ii)) מבוסס על תכונות מורפולוגיות של הגלמים melanogaster דרוזופילה . לביום היא השיטה הנפוצה ביותר של מורפולוגי הזמני התפתחותית18. במחקר הקודם, ביצענו staging הגולמי של דרוזופילה guttifera להקים בסיס הכנף פיגמנטציה מחקרים19. Guttifera ד יש דפוס שחור עם נקודות על הכנפיים והוא אחד המינים מודל עבור אגף פיגמנטציה היווצרות20. למרות הפננו את הקריטריונים מורפולוגי שמתואר Bainbridge של Bownes’ מחקר17, מדדנו ישירות משכים הבמה על ידי תצפיות טורי19, במקום להשתמש שערוך Bainbridge ו Bownes’ הבמה המשכים מתדר שנצפו. כאן נתאר את השיטה של היערכות הגולמי ואת מדידה של המשכים של הגולמי שלבי דרוזופילה בשימוש ואחFukutomi19.
ללמוד מנגנון התפתחותית של אגף פיגמנטציה, עלינו לדעת מתי בשלבים הגולמי או למבוגרים הפיגמנטציה. Fukutomi et al. 19 לכמת צפיפות אופטית (נחמד) של פיגמנטציה בשלבים הגולמי ומבוגרים על-ידי ניתוח תמונות של תמונות כנף. הפיגמנטציה של כנפיים דרוזופילה נחשב נגרמת על ידי הצטברות של מלנין שחור21. על כימות של מקרי מוות ממנת יתר, שימשו תמונות גווני אפור ו- ImageJ תוכנה (https://imagej.nih.gov/ij/)22 . כדי לזהות ולכמת את הפיגמנטציה במקום ספציפי (ΔOD), אנחנו להחסיר OD מחוץ נקודה OD בתוך מקום. כדי להפוך שיטה זו אובייקטיבית הדירים, המקומות יתר המידה צריך להיות נחוש באמצעות אגף ורידים כמו ציוני דרך. במאמר זה נתאר בפירוט שיטה זו של כימות של פיגמנטציה כנף ב דרוזופילה guttifera.
Protocol
Representative Results
Discussion
נתאר כאן את הפרוטוקולים עבור ההגדרה של שלבים הגולמי, הסרת את puparium להשגחה מפורט, מדידת המשכים של שלבים הגולמי, מידת האינטנסיביות של כתמים שחורים על כנף ב guttifera ד. פרוטוקולים אלה יכול להיות מיושם עבור רבים דרוזופילה , הקשורות לטוס זן במיוחד עם כנף פיגמנטציה.
התבוננות ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים קרול B. שון וורנר תומאס על מתן מניות לעוף, Naoyuki הפתיל עבור ציוד, ביונג ג’ין סוק על עזרתו מצלם אגאטה Kiyokazu על הייעוץ, נקאג’ימה אליזבת לצורך עריכה באנגלית. עבודה זו נתמכה על ידי KAKENHI 17K 19427 ו טקדה למדע.
Materials
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits – C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits – C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 – 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
Referências
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S., Hecht, M. K., Steere, W. C. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. , 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O’Grady, P. M. . Drosophila: a guide to species identification and use. , (2006).
- Patterson, J. T. . The Drosophilidae of the southwest. 4313, 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. . Drosophilids of the Midwest and Northeast. , (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud’homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Sekimura, T., Nijhout, H. F. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. , (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. . Heterochrony: the evolution of ontogeny. , (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners’ guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
