في فيفو حاجز الدم في الدماغ نفاذية مقايسة في الفئران باستخدام المسمى فلوريسسينتلي تتبع
Summary
نقدم هنا مقايسة نفاذية الأوعية الدموية الدماغ ماوس استخدام الحقن داخل لتتبع الفلورسنت تليها التروية التي تنطبق على نماذج حيوانية من اختلال وظيفي في حاجز الدم في الدماغ. يتم استخدام أحد نصفي الدماغ لتقييم نفاذية كمياً، وأخرى للتتبع التصور/إيمونوستينينج. يستغرق الإجراء 5-6 ح للفئران 10.
Abstract
حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو حاجز متخصصة الذي يحمي المكروية المخ من السموم ومسببات الأمراض في الدورة الدموية ويحافظ على التوازن في الدماغ. المواقع الرئيسية للجدار هي خلايا بطانية من الشعيرات الدموية الدماغ وظيفة الحاجز الذي ينتج من ضيق الوصلات بين الخلايا والناقلين افلوكس أعرب عن غشاء البلازما. وينظم هذه الدالة بيريسيتيس وأستروسيتيس التي تشكل معا وحدة neurovascular (NVU). العديد من الأمراض العصبية مثل السكتة الدماغية، مرض الزهايمر (AD)، أورام الدماغ ترتبط بوظيفة BBB البصر. ولذلك تقييم نفاذية BBB عاملاً حاسما في تقييم مدى خطورة الأمراض العصبية ونجاح استراتيجيات المعالجة المستخدمة.
نحن الحاضرين هنا بسيطة بعد فحص نفاذية قوية التي تم تطبيقها بنجاح على الماوس عدة نماذج على حد سواء، الوراثية والتجريبية. الأسلوب الكمي للغاية وموضوعية بالمقارنة مع تحليل fluorescence الراسم بالفحص المجهري الذي يتم تطبيقه عادة. في هذا الأسلوب، يتم حقن الفئران إينترابيريتونيلي مع مزيج تتبع الفلورسنت خاملة مائي متبوعاً أنيسثيتيزينج الفئران. يتم تنفيذ التروية القلبية للحيوانات قبل الحصاد المخ أو الكلي أو الأجهزة الأخرى. تجانس وفصل الأجهزة متبوعاً بقياس الأسفار من المادة طافية. الدم مستمدة من ثقب القلب قبل التروية يخدم غرض تطبيع إلى حجرة الأوعية الدموية. هو تطبيع fluorescence الأنسجة للأسفار المصل والوزن الرطب للحصول على كمية مؤشر نفاذية الراسم. لتأكيد إضافية، يمكن أن تستخدم contralateral هيمي-الدماغ الحفاظ على إيمونوهيستوتشيميستري لأغراض التتبع fluorescence التصور.
Introduction
حاجز الدم في الدماغ (BBB) يتألف من خلايا بطانية microvascular (ECs) يدعمه مرتبطة ارتباطاً وثيقا بيريسيتيس (أجهزة الكمبيوتر)، وانشيثيد في الصفيحة القاعدية، وأستروسيتيس (ACs) بتغليف الغشاء الطابق السفلي مع النهاية أقدامهم1 ،2. ECs تتفاعل مع العديد من أنواع الخلايا التي دعم وتنظيم وظيفة الحاجز، رابطة الدول الكاريبية وأجهزة الكمبيوتر، وفي المقام الأول، وأيضا الخلايا العصبية و microglia، كلها معا تشكل وحدة neurovascular (NVU). NVU حاسم بالنسبة لوظيفة BBB، مما يحد من نقل السموم المنقولة بالدم والمسببة للأمراض من الدخول إلى الدماغ. هذه الوظيفة هي نتيجة لضيق مفرق جزيئات مثل كلودين-5، أوككلودين، زونولا أوككلودينس-1، التي موجودة بين ECs وأيضا بسبب عمل الناقلين مثل فبروتين/سكري (ف-gp) efflux تلك الجزيئات التي تدخل البطانة بالعودة إلى سفينة التجويف1،،من23. ومع ذلك يسمح بي بي بي لنقل الجزيئات الأساسية مثل المواد الغذائية (السكر، والحديد، والأحماض الأمينية) من الناقلين محددة أعربت المفوضية الأوروبية أغشية البلازما1،2،3. الغاية هو الاستقطاب طبقة الجماعة الأوروبية فيما يتعلق بتوزيع ناقلات مختلفة بين لومينال (الدم-تواجه) وأبلومينال (أغشية الدماغ المواجه) للسماح نقل محددة واتجاهي الدالة4،5 . بينما BBB الحماية فيما يتعلق بأحكام تنظم الوسط الجهاز العصبي المركزي، تحديا رئيسيا لإيصال المخدرات الجهاز العصبي المركزي في أمراض مثل باركنسون مع BBB وظيفية. حتى في الأمراض العصبية مع بي بي بي خلل وظيفي، أنه لا يمكن افتراض أن زيادة إيصال المخدرات الدماغ لا سيما والخلل في الحاجز ويمكن أن تشمل الأضرار بأهداف محددة الناقل على سبيل المثال كما هو الحال في مرض الزهايمر (AD). في الإعلان، تعرف العديد من الناقلين بيتا اميلويد مثل LRP1، الغضب، فسباق الجائزة الكبرى لتكون dysregulated واستهداف متعهدي النقل هذه ومن ثم قد يكون من غير المجدي6،،من78. هو ضعف BBB في العديد من الأمراض العصبية مثل السكتة الدماغية، الإعلانية، والتهاب السحايا، التصلب المتعدد، وفي الدماغ الأورام9،،من1011. استعادة وظيفة الحاجز جزءا أساسيا من استراتيجية علاجية وهكذا يتم تقييمه الحرجة.
في هذا العمل، لقد قمنا بوصف موضوعي وبروتوكول الكمية لفحص النفاذية في القوارض ونحن تطبيقها بنجاح على عدة خطوط الماوس كلا المرض وراثيا والتجريبية نماذج10،12،13 ،14. ويستند الأسلوب حقنه داخل بسيطة لتتبع الفلورسنت يليه نضح الفئران لإزالة تتبع من حجرة الأوعية الدموية. المخ والأجهزة الأخرى هي نضح الوظيفة التي تم جمعها والنفاذيه بهدف تقييم ومؤشر نفاذية المطلق استناداً إلى قياسات الأسفار من الأنسجة هوموجيناتيس في قارئ لوحة. يتم تصحيح جميع الأسفار الخام القيم للخلفية باستخدام هوموجيناتيس الأنسجة أو المصل من الحيوانات الصورية التي لا تتلقى أي التتبع. وترد نورماليزيشنز وافرة لحجم المصل والمصل الأسفار ووزن الأنسجة، وهكذا تسفر عن مؤشر نفاذية المطلق وقابلة للمقارنة بين تجارب وأنواع الأنسجة. تيسيرا للمقارنة بين المجموعات، ويمكن تحويل قيم الفهرس نفاذية المطلق لنسب سهولة كما كان يؤديها قبل12. وفي الوقت نفسه، ويمكن الاستفادة العقول هيمي المخزنة والكلى للتصور الراسم بالأسفار مجهرية10. يمكن أن يكون الفحص المجهري fluorescence الكلاسيكية قيماً في الحصول على الفرق الإقليمية في نفاذية لو مرهقة بسبب اختيار ذاتي من أقسام النسيج والصور لتحليل شبه كمي. الخطوات التفصيلية التي ترد في البروتوكول، ويتم إضافة الملاحظات عند الاقتضاء. وهذا يوفر المعلومات اللازمة لأداء فحص النفاذية في فيفو بنجاح في الفئران التي يمكن تحجيمها إلى غيرها من الحيوانات الصغيرة. يمكن تطبيقها في التحليل لأنواع كثيرة من تتبع السماح للتهمة والحجم على أساس تقييم نفاذية بمزيج من تتبع مع الأطياف fluorescence متميزة.
Protocol
Representative Results
Discussion
حاجز الدم في الدماغ خلل يرتبط بعدد من الاضطرابات العصبية، بما في ذلك أورام الدماغ الأولية والثانوية أو السكتة الدماغية. وكثيراً ما يرتبط تصنيف BBB بذمة CNS مهددة للحياة. توضيح الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى فتح أو إغلاق BBB هو ولذلك من الأهمية العلاجية في الاضطرابات العصبية، وعادة بالتحقيق في…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تود أن تقر كونسورتيوم سفينجونيت الممول من مؤسسة ليدوق لدعم هذا العمل. كما أيد هذا العمل مركز البحوث التعاونية “التمايز الأوعية الدموية وإعادة عرض” (CRC/Transregio23، ومشروع C1) وقبل 7. وتنظيم الأسرة، كوفوند، وغوته الدولي Postdoc برنامج الذهاب في، 291776 رقم التمويل. ونعترف كذلك سومر كاثلين لها المساعدة التقنية مع الفئران المناولة والتنميط.
Materials
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer’s disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
- Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
- Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer’s disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
- Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
- Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
- Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
- Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
- Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
- Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
- Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
- Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
- Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
- Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
- Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
- Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -. Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
- Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).
