Her præsenterer vi en mus hjernen vaskulær permeabilitet analyse ved hjælp af intraperitoneal injektion af fluorescerende sporstoffer efterfulgt af perfusion, der er gældende for animalske modeller af blod – hjerne barrieren dysfunktion. Én hemi-hjerne bruges til vurdering af permeabilitet kvantitativt, og den anden for tracer visualisering/immunfarvning. Proceduren tager 5-6 h for 10 mus.
Blod – hjerne barrieren (BBB) er en specialiseret barriere, som beskytter hjernen mikromiljø fra toksiner og patogener i omløb og vedligeholder hjernen homøostase. De vigtigste steder af barrieren er endotelceller af hjernen kapillærerne hvis barriere funktion resultater fra stramme intercellulære kryds og efflux transportvirksomheder udtrykt på plasmamembran. Denne funktion er reguleret af pericytes og astrocytter, der tilsammen udgør den neurovaskulære enhed (NVU). Flere neurologiske sygdomme som slagtilfælde, Alzheimers sygdom (AD), hjernetumorer er forbundet med en nedsat BBB funktion. Vurdering af BBB permeabilitet er derfor afgørende for evaluering af sværhedsgraden af den neurologiske sygdom og succes af behandling strategier ansat.
Vi præsenterer her en simpel endnu robust permeabilitet assay, der har været anvendt med succes til flere mus modeller både, genetiske og eksperimenterende. Metoden er meget kvantitative og objektive i forhold til tracer fluorescens analyse af mikroskopi, der er almindeligt anvendt. I denne metode, er mus indsprøjtet intraperitoneal med en blanding af vandig inert fluorescerende sporstoffer efterfulgt af bedøve musene. Hjerte perfusion af dyrene er udført før høst hjerne, nyrer og andre organer. Organer er homogeniseret og centrifugeres efterfulgt af fluorescens målingen fra supernatanten. Blodet fra de kardiale punktering lige før perfusion serverer til normalisering formål, den vaskulære rum. Væv Fluorescens er normaliseret til den våde vægt og serum fluorescens at opnå en kvantitativ tracer permeabilitet indeks. For yderligere bekræftelse, kan de kontralaterale hemi-hjerne bevaret for Immunhistokemi udnyttes til tracer fluorescens visualisering formål.
Blod – hjerne barrieren (BBB) består af mikrovaskulære endotelceller (ECs) understøttes af tæt forbundet pericytes (pc’er), som er ensheathed i basal lamina, og astrocytter (ACs), indhylle basalmembranen med deres ende-fødder1 ,2. ECs interagere med flere celletyper, der understøtter og regulere den barriere funktion, primært ACs og pc’er, og også neuroner og mikroglia, alle sammen danner neurovaskulære enhed (NVU). NVU er kritisk for funktionen af BBB, som begrænser transport af blodbårne toksiner og patogener i at trænge ind i hjernen. Denne funktion er et resultat af stram vejkryds molekyler såsom claudin-5, occludin, zonula occludens-1, som er til stede mellem ECs og også på grund af virkningen af transportvirksomheder som p-glykoprotein (P-gp) at efflux molekyler, der indtaste endotelet tilbage i fartøj lumen1,2,3. BBB giver dog mulighed for transport af vigtige molekyler såsom næringsstoffer (glucose, jern, aminosyrer) af specifikke transportvirksomheder givet udtryk for på EF plasma membraner1,2,3. EF-lag er meget polariseret med hensyn til fordelingen af de forskellige transportvirksomheder mellem luminale (blod-vender) og abluminal (hjerne-vender membraner) at give mulighed for den specifikke og vektorielt transport funktion4,5 . Mens BBB er beskyttende over for stramt regulering CNS milieu, er det en stor udfordring for CNS medicinafgivelse i sygdomme som Parkinsons med en funktionel BBB. Selv i neurologiske sygdomme med BBB dysfunktion, kan det antages, at hjernen medicinafgivelse er øget især som barriere dysfunktion kan omfatte skader på de særlige transporter mål for eksempel som i Alzheimers sygdom (AD). I Annoncen, flere amyloid beta transportvirksomheder som LRP1, RASERI, P-gp er kendt for at være dysregulated og dermed målrette disse transportvirksomheder kan være nytteløs6,7,8. BBB er forringet i flere neurologiske sygdomme som slagtilfælde, annonce, meningitis, sklerose, og i hjerne tumorer9,10,11. Genoprette funktionen barriere er en afgørende del af den terapeutiske strategi og dermed dens vurdering er kritisk.
I dette arbejde, har vi beskrevet en objektiv og kvantitativ protokol for permeabilitet assay i gnavere, vi med held anvendt til flere mus linjer begge transgene og eksperimenterende sygdom modeller10,12,13 ,14. Metoden er baseret på en simpel intraperitoneal injektion af fluorescerende sporstoffer efterfulgt af perfusion af musene at fjerne røbestoffer fra det vaskulære rum. Hjernen og andre organer er indsamlet post perfusion og permeabilitet vurderet af en objektiv og absolutte permeabilitet indeks baseret på fluorescens målinger af væv homogeniseret i en pladelæseren. Alle rå fluorescens værdier er korrigeret for baggrunden ved hjælp af væv homogeniseret eller serum fra sham dyr, der ikke modtager nogen tracer. Rigelig normalizations medtages for serum volumen, serum fluorescens og vægten af væv, hvilket giver permeabilitet indeks, der er absolut og sammenlignelige mellem eksperimenter og vævstyper. For at lette sammenligning mellem grupper, kan de absolutte permeabilitet indeksværdier let omdannes til nøgletal som vi havde udført tidligere12. Samtidigt, kunne gemte hemi-hjerne og nyrer udnyttes til tracer visualisering af Fluorescens mikroskopi10. Den klassiske Fluorescens mikroskopi kunne være værdifuldt at opnå regional forskel i permeabilitet, omend besværlig på grund af subjektive udvalg af væv sektioner og billeder til en semi-kvantitative analyse. De detaljerede trin præsenteres i protokollen og noter er tilføjet eventuelt. Dette giver de nødvendige oplysninger for at held udføre i vivo permeabilitet assay i mus, der kan skaleres til andre små dyr. Analysen kan anvendes til mange former for røbestoffer giver mulighed for beregning og størrelse baseret permeabilitet vurdering af en kombination af røbestoffer med særskilte fluorescens-spektre.
Blod – hjerne barrieren dysfunktion er forbundet med en række neurologiske lidelser, herunder primære og sekundære hjernesvulster eller slagtilfælde. BBB opdeling er ofte forbundet med livstruende CNS ødem. Udredning af de molekylære mekanismer, der udløser åbning eller lukning af BBB er derfor af terapeutisk betydning i neurologiske og almindeligt undersøgt af forskere. Dog metoder til at undersøge BBB permeabilitet i vivo rapporteret i litteraturen, er ofte forbundet med tekniske vanskeligheder, der …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Sphingonet consortium finansieret af instituttets Leduq til støtte for dette arbejde. Dette arbejde blev også støttet af Collaborative Research Center “vaskulære differentiering og remodellering” (CRC / Transregio23, projekt C1) og af 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc program GO-IN, No. 291776 finansiering. Vi anerkender desuden Kathleen Sommer for hendes teknisk bistand med mus, håndtering og genotypebestemmelse.
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
384-well black plate | Greiner | 781086 | |
slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
microcentrifuge | eppendorf | 5415R |