In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים
Summary
כאן נציג של assay חדירות כלי דם במוח העכבר באמצעות הזרקה בקרום הבטן של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף הרלוונטיים מודלים חייתיים של תפקוד לקוי של מחסום הדם – מוח. חמי-המוח משמש עבור הערכת חדירות באופן כמותי, והשני עבור מעקב חזותי/immunostaining. התהליך לוקח ב’ 5-6-10 עכברים.
Abstract
מחסום הדם – מוח (BBB) היא מכשול מיוחדים מגן microenvironment למוח את הרעלים ואת פתוגנים במחזור ושומר על הומאוסטזיס המוח. האתרים העיקריים של המכשול הם תאי אנדותל של הנימים במוח שתפקידם המכשול נובעת צמתי המערכת צר, מסועי בזרימת הביע על קרום פלזמה. פונקציה זו מוסדר על ידי pericytes, האסטרוציטים היוצרים יחד את יחידת נוירו-וסקולריים (NVU). מספר מחלות נוירולוגיות כגון שבץ, מחלת אלצהיימר (AD), גידולים במוח קשורים עם תפקוד לקוי BBB. הערכה של החדירות BBB לכן חשוב בהערכת חומרת המחלה הנוירולוגית וההצלחה של אסטרטגיות טיפול המועסקים.
אנו מציגים כאן פשוטה אך assay חדירות חזקות זה הוחלו בהצלחה על העכבר מספר מודלים שניהם, גנטית ו ניסיוני. השיטה היא מאוד כמותי ואובייקטיבי לעומת הניתוח פלורסצנטיות מעקב על ידי מיקרוסקופ שמוחל כלל. בשיטה זו, עכברים מוזרקים intraperitoneally עם שילוב של מימית המשדרים פלורסנט אינרטי ואחריו מאלחש העכברים. זלוף הלב של בעלי החיים מבוצע לפני הקטיף במוח, בכליות או איברים אחרים. האיברים הומוגני, centrifuged ואחריה פלורסצנטיות מדידה תגובת שיקוע. דם מן הלב הניקוב רק לפני זלוף משמש לצורך נורמליזציה כדי תא כלי הדם. קרינה פלואורסצנטית הרקמה הוא מנורמל כדי פלורסצנטיות משקל, סרום רטוב להשיג כמותיים מעקב חדירות אינדקס. לאישור נוסף, contralateral המי-המוח יחסית אימונוהיסטוכימיה יכול להיות מנוצל למטרות הדמיה פלורסצנטיות מעקב.
Introduction
מחסום הדם – מוח (BBB) מורכב microvascular אנדותל התאים (ECs) נתמך על ידי הדוק pericytes (אישיים), אשר ensheathed בתוך הנדן הבזליים, ו האסטרוציטים (ACs) זה לעטוף את קרום המרתף ברגליים הסוף-1 ,2. ECs אינטראקציה עם מספר סוגי תאים תומכים, לווסת את הפונקציה מכשול, בעיקר ACs ומחשבים, גם נוירונים ואת מיקרוגלייה, אשר כולם יחד יוצרים יחידת נוירו-וסקולריים (NVU). NVU היא קריטית עבור הפונקציה של BBB, אשר מגביל את התעבורה של רעלים נישא בדם, פתוגנים מלהיכנס המוח. פונקציה זו היא תוצאה של מולקולות חזק-צומת claudin-5, occludin, zonula occludens-1, אשר נמצאים בין ה-ECs וגם עקב הפעולה של מובילי כגון p-גליקופרוטאין (P-gp) בזרימת את מולקולות מזין את אנדותל בחזרה כלי לומן1,2,3. BBB עם זאת מאפשר עבור הובלה של מולקולות חיוניים כגון חומרים מזינים (גלוקוז, ברזל, חומצות אמינו) על ידי מובילי ספציפיים הביע על2,31,ממברנות פלזמה EC. השכבה EC הוא מקוטב מאוד לגבי חלוקת למעליות שונים בין luminal (דם הפונה) לבין abluminal (המוח הפונה ממברנות) כדי לאפשר וקטורי וספציפית התחבורה פונקציה4,5 . בעוד BBB הוא מגן ביחס בחוזקה המסדיר את חצרו CNS, זה אתגר גדול עבור משלוח סמים CNS מחלות כגון פרקינסון עם BBB פונקציונלי. אפילו במחלות נוירולוגיות עם תפקוד לקוי של BBB, זה לא יכול להניח כי משלוח סמים המוח מוגברת במיוחד בזכות תפקוד המחסום יכול לכלול נזק על מטרות טרנספורטר ספציפי למשל כמו מחלת אלצהיימר (AD). לספירה, מספר שנאים עמילואיד ביתא כגון LRP1, זעם, P-gp ידועים להיות dysregulated, ומכאן מיקוד שנאים אלה עשוי להיות חסר תועלת6,7,8. BBB היא נפגעת מספר מחלות נוירולוגיות כגון שבץ מוחי, לספירה, דלקת קרום המוח,-טרשת נפוצה, ואת המוח גידולים9,10,11. שחזור הפונקציה מכשול הוא חלק חיוני של האסטרטגיה הטיפולית, ובכך בהערכתו הוא קריטי.
בעבודה זאת, שתיארנו אובייקטיבית, הפרוטוקולים כמותית של חדירות assay בחולדות כי אנחנו הוחלו בהצלחה מספר קווים העכבר בשתי מחלות הטרנסגניים וניסויים מודלים10,12,13 ,14. השיטה מבוססת על זריקה בקרום הבטן פשוטה של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף של העכברים כדי להסיר את המשדרים תא כלי הדם. למוח ולאיברים נוספים הם פוסט שנאספו זלוף, חדירות לאומדן אובייקטיבית ואינדקס חדירות מוחלטת על סמך מדידות קרינה פלואורסצנטית של רקמת homogenates ב קורא צלחת. כל הערכים פלורסצנטיות raw מתוקנות על רקע באמצעות רקמות homogenates או סרום מחיות המזויפים שאינם מקבלים כל מעקב. Normalizations בשפע כלולים עבור נפח סרום נסיוב פלורסצנטיות, המשקל של הרקמות, ובכך מניב אינדקס חדירות מוחלטת, השוואה בין סוגי רקמות ניסויים. כדי להקל על ההשוואה בין הקבוצות, ערכי אינדקס חדירות מוחלט יכול בקלות להיהפך ל יחסי כפי שאנחנו ביצע בעבר12. במקביל, מאוחסנות המי-המוח וכליות יכול להיות מנוצל להמחשת נותב על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ10. מיקרוסקופיה זריחה קלאסי יכול להיות יקר בהשגת אזורי השוני חדירות אמנם מסורבלת עקב בחירה סובייקטיבית של מקטעי רקמת ותמונות עבור ניתוח כמותי למחצה. השלבים המפורטים מוצגים בפרוטוקול, הערות נוספות בהתאם לצורך. פעולה זו מספקת את המידע הדרוש לביצוע בהצלחה וזמינותו חדירות ב- vivo בעכברים כי ניתן לשנות אחרים חיות קטנות. הבדיקה ניתן להחיל על סוגים רבים של המשדרים ומאפשר את החיוב ואת הגודל המבוסס על חדירות הערכה ע י שילוב של המשדרים עם פלורסצנטיות ברורים ספקטרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחסום הדם – מוח בתפקוד מזוהה עם מספר רב של הפרעות נוירולוגיות, כולל גידולים במוח העיקרי והמשני או שבץ מוחי. התפלגות BBB קשורה לעיתים קרובות עם בצקת CNS סכנת חיים. הבהרה של המנגנון המולקולרי המפעילות את פתיחת או סגירת BBB ולכן חשיבות טיפולית בהפרעות נוירולוגיות, בדרך כלל נחקר על ידי חוקרים. עם זא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר קונסורציום Sphingonet במימון קרן Leduq לתמיכה עבודה זו. עבודה זו גם נתמך על ידי המרכז לחקר שיתופי “בידול וסקולרית ובניה” (CRC / Transregio23, פרויקט C1) ועל -ידי 7. FP, COFUND, גתה הבינלאומי פוסטדוק תוכנית קדימה-פנימה, מס 291776 מימון. אנו עוד יותר להכיר קתלין זומר לסיוע טכני שלה עם עכברים טיפול ו genotyping.
Materials
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer’s disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
- Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
- Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer’s disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
- Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
- Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
- Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
- Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
- Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
- Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
- Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
- Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
- Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
- Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
- Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
- Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -. Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
- Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).
