एक Vivo में रक्त-चूहों में मस्तिष्क बाधा पारगम्यता परख फ्लोरोसेंट लेबल अनुरेखकों का उपयोग
Summary
यहां हम एक माउस मस्तिष्क संवहनी पारगम्यता intraperitoneal फ्लोरोसेंट अनुरेखक के इंजेक्शन का उपयोग छिड़काव द्वारा पीछा किया है कि रक्त मस्तिष्क बाधा रोग के पशु मॉडलों के लिए लागू होता है । एक hemi-मस्तिष्क पारगम्यता मात्रात्मक और अनुरेखक दृश्य के लिए अन्य के आकलन के लिए प्रयोग किया जाता है immunostaining/ प्रक्रिया 10 चूहों के लिए 5-6 ज लेता है ।
Abstract
ब्लड-ब्रेन बैरियर (BBB) एक विशेष बाधा है जो रक्त परिसंचरण में विषाक्त पदार्थों और रोगजनकों से मस्तिष्क microenvironment की रक्षा करता है और मस्तिष्क homeostasis को बनाए रखता है । बैरियर की प्रमुख साइटें मस्तिष्क केशिकाओं की endothelial कोशिकाएं होती हैं, जिनका बैरियर फंक्शन परिणाम तंग सेलुलर जंक्शनों और समाप्ति ट्रांसपोर्टरों से प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्त होता है । इस समारोह pericytes और astrocytes द्वारा विनियमित है कि एक साथ neurovascular इकाई (NVU) फार्म । कई स्नायविक रोगों जैसे स्ट्रोक, अल्जाइमर रोग (AD), ब्रेन ट्यूमर एक बिगड़ा BBB समारोह के साथ जुड़े रहे हैं. BBB पारगम्यता का आकलन इसलिए मस्तिष्क संबंधी रोग की गंभीरता का मूल्यांकन करने में महत्वपूर्ण है और उपचार रणनीतियों की सफलता के लिए कार्यरत.
हम यहां एक सरल अभी तक मजबूत पारगम्यता परख है कि सफलतापूर्वक कई माउस मॉडल दोनों, आनुवंशिक और प्रयोगात्मक करने के लिए लागू किया गया है वर्तमान । विधि अत्यधिक मात्रात्मक और सूक्ष्मता है कि सामांयतः लागू किया जाता है द्वारा अनुरेखक प्रतिदीप्ति विश्लेषण की तुलना में उद्देश्य है । इस विधि में, चूहों anesthetizing चूहों के द्वारा पीछा जलीय निष्क्रिय फ्लोरोसेंट अनुरेखक का एक मिश्रण के साथ intraperitoneally इंजेक्ट कर रहे हैं. कार्डियक छिड़काव जानवरों की कटाई मस्तिष्क, गुर्दे या अन्य अंगों से पहले किया जाता है । अंगों homogenized और supernatant से प्रतिदीप्ति माप के बाद केंद्रापसारक हैं । हृदय पंचर से खींचा रक्त बस से पहले छिड़काव संवहनी डिब्बे के लिए सामान्य प्रयोजन के लिए कार्य करता है. ऊतक प्रतिदीप्ति गीला वजन और सीरम प्रतिदीप्ति के लिए सामान्यीकृत है एक मात्रात्मक अनुरेखक पारगम्यता सूचकांक प्राप्त करने के लिए. अतिरिक्त पुष्टि के लिए, contralateral hemi-immunohistochemistry के लिए संरक्षित मस्तिष्क अनुरेखक प्रतिदीप्ति दृश्य प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जा सकता है.
Introduction
रक्त-मस्तिष्क बाधा (BBB) microvascular endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) द्वारा समर्थित बारीकी से संबद्ध pericytes (पीसी), जो बेसल ensheathed में लेमिना हैं, और astrocytes (ACs) है कि उनके अंत फुट के साथ तहखाने झिल्ली ढंक के होते हैं1 ,2. ईसीएस कई सेल प्रकार है कि समर्थन और बाधा समारोह, मुख्य रूप से ACs और पीसी को विनियमित करने के साथ बातचीत, और भी न्यूरॉन्स और microglia, सभी जिनमें से एक साथ neurovascular इकाई (NVU) फार्म. NVU BBB, जो रक्त जनित विषाक्त पदार्थों और मस्तिष्क में प्रवेश करने से रोगजनकों के परिवहन की सीमा के समारोह के लिए महत्वपूर्ण है । इस समारोह में इस तरह के claudin-5, occludin, zonula occludens-1, जो ईसीएस के बीच मौजूद है और भी ऐसे पी के रूप में ट्रांसपोर्टरों की कार्रवाई के कारण ग्लाइकोप्रोटीन (पी जीपी) के रूप में तंग जंक्शन अणुओं का परिणाम है कि समाप्ति अणुओं है कि endothelium में वापस प्रवेश पोत लुमेन1,2,3. BBB लेकिन ऐसे पोषक तत्वों के रूप में आवश्यक अणुओं के परिवहन के लिए अनुमति देता है (ग्लूकोज, लौह, एमिनो एसिड) विशिष्ट चुनाव आयोग प्लाज्मा झिल्ली1पर व्यक्त ट्रांसपोर्टरों द्वारा,2,3। चुनाव आयोग परत अत्यधिक चमकदार (रक्त का सामना करना पड़) और abluminal (मस्तिष्क-सामना झिल्ली) के बीच विभिंन ट्रांसपोर्टरों के वितरण के संबंध में ध्रुवीकरण के लिए अनुमति देने के लिए विशिष्ट और वैक्टर परिवहन समारोह4,5 . जबकि BBB कसकर सीएनएस वातावरण को विनियमित करने के संबंध में सुरक्षात्मक है, यह एक कार्यात्मक BBB के साथ पार्किंसंस जैसे रोगों में सीएनएस दवा वितरण के लिए एक प्रमुख चुनौती है । BBB रोग के साथ मस्तिष्क संबंधी रोगों में भी, यह नहीं माना जा सकता है कि मस्तिष्क दवा वितरण विशेष रूप से बाधा रोग उदाहरण के लिए अल्जाइमर रोग (विज्ञापन) के रूप में विशिष्ट ट्रांसपोर्टर लक्ष्य को नुकसान शामिल हो सकता है के रूप में वृद्धि हुई है । विज्ञापन में, LRP1, क्रोध, पी जीपी के रूप में कई amyloid बीटा ट्रांसपोर्टरों dysregulated होने के लिए जाना जाता है और इसलिए इन ट्रांसपोर्टरों लक्ष्यीकरण व्यर्थ हो सकता है6,7,8। BBB स्ट्रोक, विज्ञापन, दिमागी बुखार, कई स्केलेरोसिस के रूप में कई स्नायविक रोगों में बिगड़ा हुआ है, और मस्तिष्क ट्यूमर में9,10,11. बाधा समारोह बहाल चिकित्सीय रणनीति का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है और इस तरह अपने आकलन महत्वपूर्ण है ।
इस काम में, हम एक उद्देश्य और में पारगम्यता परख के लिए मात्रात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है कुतर कि हम सफलतापूर्वक कई माउस लाइनों के लिए लागू दोनों ट्रांसजेनिक और प्रयोगात्मक रोग मॉडल10,12,13 ,14. विधि फ्लोरोसेंट अनुरेखकों की एक सरल intraperitoneal इंजेक्शन चूहों के छिड़काव द्वारा पीछा संवहनी से नाड़ी डिब्बे को दूर करने के लिए पर आधारित है. मस्तिष्क और अंय अंगों के बाद छिड़काव और एक उद्देश्य और निरपेक्ष पारगम्यता सूचकांक एक प्लेट रीडर में ऊतक homogenates के प्रतिदीप्ति माप के आधार पर मूल्यांकन के बाद एकत्र कर रहे हैं । सभी कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों की पृष्ठभूमि के लिए सही है कि किसी भी अनुरेखक प्राप्त नहीं है कि अन्तर्वासना जानवरों से ऊतक homogenates या सीरम का उपयोग कर. पर्याप्त सामांयीकरण सीरम की मात्रा, सीरम प्रतिदीप्ति, और ऊतकों के वजन के लिए शामिल हैं, इस प्रकार पारगम्यता सूचकांक है कि निरपेक्ष है और प्रयोगों और ऊतक प्रकार के बीच तुलनीय उपज. समूहों के बीच तुलना में आसानी के लिए, निरपेक्ष पारगम्यता सूचकांक मूल्यों को आसानी से अनुपात में तब्दील किया जा सकता है के रूप में हम पहले12प्रदर्शन किया था । समवर्ती, संग्रहित hemi-दिमाग और गुर्दे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी10द्वारा अनुरेखक दृश्य के लिए उपयोग किया जा सकता है. क्लासिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पारगम्यता में क्षेत्रीय अंतर प्राप्त करने में मूल्यवान हो सकता है, हालांकि एक अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए ऊतक वर्गों और छवियों के व्यक्तिपरक चयन के कारण बोझिल. विस्तृत कदम प्रोटोकॉल में प्रस्तुत कर रहे हैं और नोट्स जहां उचित जोड़ा जाता है । यह सफलतापूर्वक अंय छोटे जानवरों के लिए स्केल किया जा सकता है कि चूहों में vivo पारगम्यता परख में प्रदर्शन के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करता है । परख के आरोप के लिए अनुमति अनुरेखकों के कई प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है और विशिष्ट प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा के साथ अनुरेखकों का एक संयोजन द्वारा आकार पारगम्यता मूल्यांकन आधारित.
Protocol
Representative Results
Discussion
रक्त मस्तिष्क बाधा रोग मस्तिष्क संबंधी विकारों की एक संख्या के साथ जुड़ा हुआ है, प्राथमिक और माध्यमिक मस्तिष्क ट्यूमर या स्ट्रोक सहित. BBB टूटने अक्सर जीवन धमकी सीएनएस शोफ के साथ जुड़ा हुआ है । आणविक तंत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक Sphingonet इस काम के समर्थन के लिए Leduq फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित कंसोर्टियम स्वीकार करना चाहते हैं । यह काम भी सहयोगात्मक अनुसंधान केंद्र द्वारा समर्थित किया गया “संवहनी विभेद और remodeling” (सीआरसी/Transregio23, परियोजना C1) और द्वारा 7. एफ पी, COFUND, गेटे इंटरनेशनल Postdoc कार्यक्रम जाना-इन, No. २९१७७६ धन । हम आगे चूहों हैंडलिंग और genotyping के साथ उसे तकनीकी सहायता के लिए कैथलीन Sommer स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
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