Burada bir fare beyin damar geçirgenliği tahlil mayi enjeksiyon kan – beyin bariyerini disfonksiyon hayvan modelleri için geçerlidir perfüzyon ardından floresan tarayıcıları kullanarak mevcut. Bir hemi-beyin geçirgenliği kantitatif değerlendirilmesi ve diğer izleme görselleştirme/immunostaining için kullanılır. Yordamı 5-6 h 10 fareler için alır.
Kan – beyin bariyerini (BBB) toksinler ve patojenler dolaşımda beyin microenvironment karşı korur ve beyin homeostazı tutar özel bir engeldir. Asıl bariyer sıkı hücreler arası kavşaklar ve plazma membran üzerinde ifade sızma taşıyıcılar bariyer fonksiyonu sonuçları beyin kapiller endotel hücreleri sitelerdir. Bu işlev perisitlerden ve birlikte nörovasküler birimi (NVU) formu astrocytes tarafından düzenlenmiştir. Felç, Alzheimer hastalığı (Ah), gibi çeşitli nörolojik hastalıklar Beyin Tümörleri bir Engelli BBB işlevi ile ilişkilidir. BBB geçirgenliği değerlendirilmesi bu nedenle nörolojik hastalığın şiddeti ve istihdam tedavi stratejileri başarı değerlendirilmesinde çok önemlidir.
Henüz birkaç fare başarıyla uygulanmış olan sağlam geçirgenliği tahlil hem genetik hem deneysel modeller Burada basit bir mevcut. Son derece nicel ve izleyici Floresans analiz tarafından yaygın olarak uygulanan mikroskobu ile karşılaştırıldığında objektif yöntemidir. Bu yöntemde, fareler intraperitoneally sulu etkisiz floresan izleyiciler fareler anesthetizing tarafından takip bir karışımı ile enjekte edilir. Kardiyak perfüzyon hayvanların beyin, böbrek veya diğer organlara hasat öncesinde gerçekleştirilir. Organları homojenize ve centrifuged floresan ölçüm tarafından süpernatant takip. Hemen önce perfüzyon kardiyak ponksiyon çizilmiş kan damar yuvası normalleştirme amaçla hizmet vermektedir. Doku floresan bir nicel elde etmek için ıslak ağırlık ve serum floresan için normalleştirilmiş izleyici geçirgenliği dizin. Ek onay için kontralateral hemi-beyin immünhistokimya için korunmuş izleyici Floresans görselleştirme amaçlar için yararlı olabilir.
Mikrovasküler endotel hücreleri (ECs) Bazal lamina ensheathed olan yakından ilişkili perisitlerden (PCs) ve sonunda ayakları1 ile membran örtmek astrocytes (ACs) tarafından desteklenen, kan – beyin bariyerini (BBB) oluşur ,2. ECs destekleyen ve bariyer fonksiyonu, öncelikle ACs ve PC’ler, düzenleyen birkaç hücre tipleri ile etkileşim ve aynı zamanda sinir hücreleri ve microglia, Bütün bunlar birlikte form nörovasküler birimi (NVU). NVU kan yoluyla toksinlerin ve patojenler beyin girmesini sınırlayan BBB, işlev için önemlidir. Bu işlev mevcut ve taşıyıcılar gibi p-glikoprotein (P-gp) bu sızma endotel girin molekülleri içine geri eylem nedeniyle ECs arasında sıkı kavşak molekülleri claudin-5, occludin, zonula occludens-1, gibi bir sonucudur gemi Lümen1,2,3. BBB ancak besin (glikoz, demir, amino asitler) gibi temel moleküllerin taşıması için özel taşıyıcılar üzerinde EC plazma membran1,2,3ifade tarafından sağlar. EC katman son derece çeşitli taşıyıcılar luminal (kan bakan) ve özel ve vektörel taşıma fonksiyonu4için,5 izin vermek için abluminal (beyin bakan membranlar) arasındaki dağılımı açısından polarize . BBB sıkıca CNS çevre düzenlenmesi ile ilgili koruyucu olmakla birlikte, CNS ilaç dağıtım fonksiyonel BBB ile Parkinson gibi hastalıklarda için büyük bir sorun olduğunu. BBB disfonksiyonu olan nörolojik hastalıklar bile, özellikle bariyer disfonksiyonu örneğin Alzheimer hastalığı (Ah) gibi belirli ışınlama hedefleri zarar dahil olabilir gibi beyin ilaç dağıtım arttığını kabul edemiyor. Yılında, birkaç amiloid beta taşıyıcılar LRP1, öfke, P-gp gibi dysregulated olduğu bilinmektedir ve bu nedenle bu taşıyıcılar hedefleme beyhude6,7,8olabilir. BBB inme, reklam, menenjit, multipl skleroz ve Beyin Tümörleri9,10,11‘ gibi çeşitli nörolojik hastalıklarda bozulmuş. Bariyer fonksiyonu geri tedavi stratejisinin önemli bir parçasıdır ve böylece onun değerlendirmesi önemlidir.
Bu çalışmada, objektif ve biz başarılı bir şekilde her iki transgenik ve deneysel hastalık modelleri10,12,13 birkaç fare satırlarına uygulanır Rodents geçirgenliği tahlil için nicel protokolü bir tarif var ,14. Yöntem izleyiciler damar yuvası kaldırmak için floresan izleyiciler tarafından farelerin perfüzyon takip basit bir mayi iğne temel alır. Beyin ve diğer organlara toplanan yazı perfüzyon ve nesne tarafından değerlendirildi geçirgenliği ve doku homogenates bir plaka okuyucu Floresans ölçümleri dayalı mutlak geçirgenliği dizin vardır. Tüm ham Floresans değerleri doku homogenates veya herhangi bir izleyici almazsınız sham hayvanlardan serum kullanarak arka plan için düzeltilir. Geniş normalizations serum cilt, serum Floresans ve böylece mutlak ve deneyler ve doku türleri arasında karşılaştırılabilir geçirgenliği dizin oluşturan dokular, ağırlığı dahil edilir. Biz daha önce12gerçekleştirilen vardı gibi gruplar arasında karşılaştırma kolaylaştırmak için mutlak geçirgenliği dizin değerlerini kolayca oranları dönüştürülebilir. Aynı anda, saklı hemi-beyin ve böbrek Floresans mikroskobu10tarafından izleyici görselleştirme için yararlanılabilir. Klasik Floresans mikroskobu geçirgenliği bölgesel farklılığı hantal olsa doku bölümü ve yarı kantitatif analiz için görüntü öznel seçim nedeniyle elde etmek önemli olabilir. Ayrıntılı adımlar iletişim kuralında sunulmaktadır ve notlar uygun olan yerlerde eklenir. Bu başarıyla diğer küçük hayvanlar için ölçeklendirilebilir farelerde vivo içinde geçirgenliği tahlil gerçekleştirmek için gerekli bilgileri sağlar. Tahlil tarayıcıları birçok türde uygulanabilir şarj ve boyutu için izin alarak geçirgenliği değerlendirme tarayıcıları farklı floresan spectra ile kombinasyonu tarafından.
Kan – beyin bariyerini disfonksiyon birincil ve ikincil Beyin Tümörleri veya felç gibi nörolojik bozukluklar, bir dizi ile ilişkilidir. BBB arıza kez hayati CNS ödem ile ilişkilidir. Bu nedenle açılış tetik moleküler mekanizmaları aydınlatma veya BBB kapatılması tedavi önemini nörolojik bozukluklar ve yaygın araştırmacılar tarafından araştırıldı. Ancak, yöntemleri araştırmak için BBB geçirgenliği vivo literatürde bildirilen Floresans görüntüleri17<sup…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar bu eser desteklemek için Leduq Vakfı tarafından finanse edilen Sphingonet Konsorsiyumu kabul etmek istiyorum. Bu eser de “vasküler farklılaşma ve modelleme” ortak araştırma merkezi tarafından desteklenmiştir (CRC / Transregio23, proje C1) ve 7. FP, COFUND, Goethe uluslararası doktora sonrası programı GO-inç, No 291776 finansman. Daha fazla Kathleen Sommer fareler ile onun teknik yardım için işleme ve Genotipleme anıyoruz.
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
384-well black plate | Greiner | 781086 | |
slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
microcentrifuge | eppendorf | 5415R |