I Vivo blod - hjerne barrieren permeabilitet analysen mus med Fluorescently merket Tracers
Summary
Her presenterer vi en mus hjernen vaskulær permeabilitet analysen bruker intraperitoneal injeksjon av fluorescerende tracers etterfulgt av perfusjon som gjelder for dyr modeller av blod – hjerne barrieren dysfunksjon. En hemi-hjerne er brukt for å vurdere permeabilitet kvantitativt, og den andre for tracer visualisering/immunostaining. Prosedyren tar 5-6 h for 10 mus.
Abstract
Blod – hjerne barrieren (BBB) er en spesialisert barriere som beskytter hjernen microenvironment fra giftstoffer og patogener i sirkulasjon og vedlikeholder hjernen homeostase. De viktigste stedene av barrieren er endotelceller av hjernen kapillærer som barriere funksjon resultater fra stramt intercellulære veikryss og middelklasseinnbyggere transportører uttrykt på plasma membranen. Denne funksjonen er regulert av pericytes og astrocyttene som sammen danner nevrovaskulære enheten (NVU). Flere nevrologiske sykdommer som slag, Alzheimers sykdom (AD), hjernesvulster er forbundet med en svekket BBB-funksjon. Vurdering av BBB permeabilitet er derfor avgjørende å evaluere alvorlighetsgraden av nevrologisk sykdom og suksessen til behandling strategier ansatt.
Vi presenterer her en enkel men robust permeabilitet analysen som er vellykket brukt flere musen modeller både genetiske og eksperimentelle. Metoden er svært kvantitative og objektiv i forhold til tracer fluorescens analysen av mikroskopi som brukes ofte. I denne metoden, er mus injisert intraperitoneally med en blanding av vandig inert fluorescerende tracers etterfulgt av anesthetizing musene. CARDIAC perfusjon av dyrene utføres før høsting hjernen, nyrene eller andre organer. Organer er homogenisert og sentrifugeres etterfulgt av fluorescens måling fra nedbryting. Blod fra den cardiac punktering like før perfusjonsmåling serverer for normalisering hensikt å vaskulære kupé. Vev fluorescens normaliseres til den våte vekt og serum fluorescensen å få en kvantitativ tracer permeabilitet indeks. For ytterligere bekreftelse, kan kontralateral hemi-hjernen bevart for immunohistochemistry benyttes for tracer fluorescens visualisering formål.
Introduction
Blod – hjerne barrieren (BBB) består av mikrovaskulær endotelceller (ECs) støttes av nært knyttet pericytes (PCs), som er ensheathed i den basale lamina, og astrocyttene (ACs) som innhylle kjelleren membranen med slutten-fot1 ,2. ECs samhandle med flere celletyper som støtter og regulere funksjonen barriere, primært ACs og PCer, og også neurons og microglia, som sammen danner nevrovaskulære enheten (NVU). NVU er avgjørende for funksjonen til BBB, som begrenser transport av blodbårne giftstoffer og patogener å hjernen. Denne funksjonen er et resultat av tett-kryss molekyler som claudin-5, occludin, zonula occludens-1, som finnes mellom ECs og også av transportører som p-glykoprotein (P-gp) at middelklasseinnbyggere molekyler angir endotelet tilbake i fartøyet lumen1,2,3. BBB men lar for transport av viktige molekyler som næringsstoffer (glukose, jern, aminosyrer) av bestemte transportører uttrykt på EC plasma membraner1,2,3. EC laget er svært polarisert med hensyn til fordelingen av ulike transportører mellom luminal (blod-mot) og abluminal (hjernen mot membraner) å tillate bestemt og vectorial funksjonen4,5 . Mens BBB er beskyttende forhold til strengt regulere CNS miljøet, er det en stor utfordring for CNS narkotika-leveranser i sykdommer som Parkinsons med en funksjonell BBB. Selv i nevrologiske sykdommer med BBB dysfunksjon, kan det antas at hjernen stoffet levering øker ettersom barriere dysfunction kan omfatte skade på bestemte transporter målene for eksempel som Alzheimers sykdom (AD). I Annonsen, flere amyloid beta transportører som LRP1, RAGE, P-gp er kjent for å være dysregulated og dermed målretting disse transportører kan være nytteløst6,7,8. BBB er svekket i flere nevrologiske sykdommer som slag, annonse, hjernehinnebetennelse, multippel sklerose, og i hjernen svulster9,10,11. Gjenopprette funksjonen barriere er en viktig del av den terapeutiske strategien og dermed sin vurdering er kritiske.
I dette arbeidet har vi beskrevet en objektiv og kvantitative protokoll for permeabilitet analysen i gnagere at vi har brukt flere musen linjer både transgene og eksperimentelle modeller10,12,13 ,14. Metoden er basert på en enkelt intraperitoneal injeksjon av fluorescerende tracers etterfulgt av perfusjon av musene fjerne tracers fra vaskulære kupé. Hjernen og andre organer er samlet innlegget perfusjon og permeabilitet vurdert av et mål og absolutt permeabilitet index basert på fluorescens målinger av vev homogenates i en plate-leser. Alle rå fluorescens verdier er korrigert for bakgrunnen med vev homogenates eller serum fra sham dyr som ikke mottar noen tracer. God normalizations er inkludert for serum volum, serum fluorescens og vekten av vev, dermed gir permeabilitet indeks som er absolutt og sammenlignbare mellom eksperimenter og vev typer. For enkel sammenligning mellom grupper, kan de absolutte permeabilitet indeksverdiene lett forvandles til prosenter som vi hadde utført tidligere12. Samtidig, kan lagrede hemi-hjerner og nyre utnyttes for tracer visualisering av fluorescens mikroskopi10. Klassiske fluorescens mikroskopi kan være verdifullt å skaffe regionale aldersforskjell permeabilitet riktignok tungvint på grunn av subjektive utvalg av vev deler og bilder for en semi kvantitativ analyse. Detaljerte trinn presenteres i protokollen og notater legges der det passer. Dette gir nødvendig informasjon for å kunne utføre i vivo permeabilitet analysen i mus som kan skaleres til andre små dyr. Analysen kan brukes til mange typer tracers slik at tillegget og størrelsen basert permeabilitet vurdering av en kombinasjon av tracers med forskjellige fluorescens spectra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Blod – hjerne barrieren dysfunksjon er forbundet med en rekke nevrologiske lidelser, inkludert primære og sekundære hjernesvulster eller slag. BBB oversikt er ofte forbundet med livstruende CNS ødem. Utviklingen av molekylære mekanismer som utløser åpning eller lukking av BBB er derfor terapeutiske betydning i nevrologiske lidelser og vanligvis undersøkt av forskere. Metoder for å undersøke BBB permeabilitet i vivo rapportert i litteraturen, er imidlertid ofte forbundet med tekniske problemer som kjedel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne Sphingonet consortium finansiert av Leduq foundation for å støtte dette arbeidet. Dette arbeidet ble også støttet av Collaborative Research Center “vaskulær differensiering og remodeling” (CRC / Transregio23, prosjektet C1) og 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc programmet gå-i, nei 291776 finansiering. Vi erkjenner Kathleen Sommer for henne teknisk hjelp med mus håndtering og genotyperingteknologi.
Materials
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer’s disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
- Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
- Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer’s disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
- Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
- Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
- Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
- Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
- Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
- Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
- Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
- Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
- Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
- Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
- Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
- Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -. Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
- Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).
