Formation de l’ADN Covalent adduits cancérogènes enzymatiquement activés et médicaments In Vitro et leur détermination par 32P-post-marquage

Summary

Évaluation de l’activité des produits chimiques environnementaux et médicaments, pour être enzymatiquement bioactivated intermédiaires générant ADN covalent adduits, est un domaine important dans le développement du cancer et son traitement. Méthodes sont décrites pour l’activation composée pour former que des adduits d’ADN, ainsi que des techniques pour leur détection et la quantification.

Abstract

Adduits à l’ADN covalent formé par des produits chimiques ou le pouvoir cancérogène des médicaments sont jugés comme l’un des facteurs plus importants dans la phase d’initiation du processus cancérigènes. Cette liaison covalente, qui est considéré comme la cause de la tumorigenèse, est maintenant considérée comme un dogme central de la cancérogenèse chimique. Ici, les méthodes sont décrites en utilisant la réaction catalysée par le cytochrome P450 et enzymes de biotransformation supplémentaires pour enquêter sur l’activité des produits chimiques ou des médicaments pour leur activation en métabolites formant ces ADN adduits. Procédures sont présentées en décrivant l’isolement des fractions cellulaires possédant des enzymes de biotransformation (échantillons microsomiques et cytosoliques avec cytochromes P450 ou d’autres enzymes de biotransformation, c.-à-d., peroxydases, NADPH : cytochrome P450 oxydoréductase, oxydoréductase de NAD (P) h ou de xanthine oxydase). De plus, on décrit des méthodes qui peut être utilisé pour l’activation du métabolisme des substances chimiques analysés par ces enzymes ainsi que ceux pour l’isolement de l’ADN. En outre, les méthodes appropriées capables de détecter et de quantifier l’ADN produit chimique/pharmaceutique-dérivé des adduits, c’est-à-dire, différentes modifications de la technique de P-post-marquage ³²et emploi des marqués radioactifs analysé des produits chimiques, sont montré en détail.

Introduction

Le métabolisme des xénobiotiques (substances chimiques environnementales ou drogues) se produit en deux phases¹. Phases I et II visent à rendre les composés initialement hydrophobes (non soluble dans l’eau) plus hydrophile (soluble dans l’eau), ce qui les rend facilement conjuguent via l’urine, de selles ou de sueur. La phase I (fonctionnalisation) réactions incluent l’oxydation, réduction, et hydroxylation catalysée par les enzymes tel le cytochrome P450s (P450s, CYP), peroxydases (i.e., cyclo-oxygénase, COX), aldo-céto réductases (AKRs), microsomique flavine monooxygénases (OGP). Phase I comprend également des réactions de réduction, véhiculées par une variété de réductases c’est-à-dire microsomique NADPH : cytochrome P450 réductase (POR) et cytosolique NAD (P) h oxydoréductase (NQO1), xanthine oxydase (XO) et aldéhyde oxydase (AO)¹ . Dans la deuxième phase (conjugaison), les groupes fonctionnels qui étaient attachés en phase I sont utilisées pour conjuguer les petites molécules polaires afin d’accroître encore la polarité. Exemples d’enzymes censées participer à la réaction de phase II incluent des sulfotransférases (résultats), N, O– acétyltransférases (NATs), méthyltransférases comme la catéchol –O– méthyltransférase (COMT), glutathion S– transférases (GST) et l’uridine diphosphate glucuronyltransférases (UGTs)¹. La nomenclature des enzymes de phase I ou II est, toutefois, pas rigide, et certaines enzymes peuvent sans doute être regroupées en deux catégories.

Enzymes P450 (EC 1.14.14.1) sont l’hème contenant les protéines présentes dans les différents organismes qui participent à la biotransformation de nombreux produits chimiques, catalyser leur conversion^3,4. Les enzymes P450 catalysent l’hydroxylation de nombreux substrats, avec une réaction où un atome de dioxygène est introduit dans la molécule de xénobiotiques, tandis que le second atome d’oxygène est réduit à l’eau forme de la réaction qui nécessite deux électrons [l’équation (1 de^3,)]⁴:

RH + O₂ + NADPH + H⁺ → ROH + H₂O + NADP⁺ (1)

Les enzymes P450 localisées dans la membrane du réticulum endoplasmique des cellules de mammifères (systèmes de P450 microsomiques) sont membres du système monooxygénase multienzymatiques, qui contient encore NADPH : cytochrome P450 réductase (POR) et du cytochrome b₅ , le substrat de l’enzyme appelée NADH : cytochrome b₅ réductase. Une théorie généralement acceptée émet l’hypothèse que le donneur des deux électrons nécessaires pour P450 est le système de NADPH/POR. Néanmoins, cytochrome b₅ pourrait exercent également comme donneur d’électrons pour P450, à savoir en tant que donateur de l’électron réduisant P450 au cours de la deuxième réduction de son cycle de réaction, où elle agit avec NADH : cytochrome b₅ réductase^2,3,4.

Les mammifères utilisent diverses enzymes P450 (par exemple, les enzymes des familles 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 et 27) pour la synthèse de composés endogènes précieux, tels que les stéroïdes et utilisez-les pour le catabolisme des produits naturels^2,3 . Les autres enzymes mammifères CYP, comme humaine CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 et 3 a 4, métabolisent exogènes substances chimiques qui sont utilisés comme médicaments. ^{5 , 6} les plus importantes enzymes catalysant le métabolisme des médicaments sont CYP de la sous-famille des 3 a, en particulier le CYP3A4. Les conversions des xénobiotiques, tels que les substances cancérogènes pro et pro-substances toxiques, sont véhiculées par les humains CYP1A1, 1 a 2, 1 b 1, 2 a 6, 2E1 et 3 a 4^2,5. La plupart de ces CYP est présente dans le foie (exception de CYP1A1 et 1 b 1). Néanmoins, le CYP est également exprimées dans plusieurs organes extrahépatiques. Ces P450s pourrait être d’une grande importance, surtout quand ils participent à la bioactivation du métabolisme des substances chimiques (médicaments) intermédiaires réactifs dans ces organes⁷. P450s divers sont induites par plusieurs composés qui sont leurs substrats, si ce n’est pas nécessairement le cas.

De nombreuses enzymes P450 jouent un rôle dans la toxicité chimique (médicament). Ils peuvent convertir les xénobiotiques non seulement dans leurs métabolites de désintoxication, mais aussi les activer pour les espèces réactives, qui modifient les macromolécules endogènes qui présentent en outre des propriétés biologiques différentes, causant habituellement leur toxicité. ADN, des lipides et des protéines peuvent être les cibles de leur modification par réactifs électrophiles et radicaux générés à partir de produits chimiques activées. Dans le cas de l’ADN, résoudre plusieurs réponses de gène important et leurs mécanismes sont déjà connus,^2,3,4,5.

Les changements dans l’ADN peuvent entraîner une diminution de contrôle de la croissance cellulaire, et ce phénomène est considéré comme le facteur prédominant qui conduisent au développement de procédés cancérogènes. La génération de l’ADN covalent des adduits avec des produits chimiques ayant le pouvoir cancérogène est jugée comme une des étapes plus importantes dans la phase d’initiation des cancérogènes traite^8,9,10,11. Il a été démontré que les relations entre la formation de l’ADN des adduits et tumorigenèse se produire, alors qu’une diminution de la quantité d’ADN adduits est responsable de la chimioprévention^{8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14}. la formation d’agent cancérigène/drogue-dérivé des adduits d’ADN repose sur des bases de l’ADN et est affectée par les séquences de ces bases dans l’ADN. Les réparations de l’ADN des adduits sont tributaires de leur emplacement (sur le brin d’ADN transcrit ou non transcrites) et les types de nucléotides modifiés séquences^{8,11,12,15, 16}.

Dans cet article, nous décrivons des procédures utilisant la conversion par catalyse enzymatique des produits chimiques (médicaments) pour enquêter sur leur puissance doit être activée en métabolites qui a modifié l’ADN (ADN de générer des adduits). Pour le couplage covalent ADN, la substance d’essai doit généralement être activé soit par réaction oxydante ou réductrice, selon médicaments individuels. Oxydante ou réductrice activation de produits chimiques testés est médiée par un système enzymatique P450-dépendants présent dans la fraction subcellulaire microsomique ou par réduction avec réductases présente aussi bien dans les microsomes (POR, NADH : cytochrome b₅ réductase, enzymes P450) et dans les fractions subcellulaires cytosoliques cellulaires (NQO1, XO, AO, peroxydase). Métabolites réactifs par la suite se lient à l’ADN formant les ADN des adduits. Parce que les réactions fois oxydants et réductrices sont importantes pour activer plusieurs médicaments pour ces espèces réactives, les procédures expérimentales qui emploient le système enzymatique de l’oxydo-réduction sont décrites. En outre, les méthodes appropriées capables de détecter et de quantifier ces ADN adduits sont décrites en détail.

Deux procédures indépendantes afin de déterminer si le produit chimique à tester, activés par les systèmes enzymatiques, est lié à l’ADN sont recommandés : la technique P-post-marquage de ³²et utilisant composé radioactif marqué (e.g., ³H ou ¹⁴ C). Pour le premier projet pilote, ³²P-post-marquage test de dépistage est recommandé. La détermination de la teneur en ADN dans les solutions, précisément évalué, doit précéder les deux méthodes.

Les ³²P-post-marquage technique utilise l’hydrolyse enzymatique de l’ADN modifié par des produits chimiques non radioactif (cancérogène/drogues) à 3´-phosphodeoxynucleosides, phosphorylation supplémentaire avec le phosphore radioactif (³²P) à la 5´- OH position et la séparation des produits chimiques-désoxyribonucléosides adduits de désoxynucléotides (non modifiées) normal par chromatographie¹⁷ (Figure 1). ADN modifié par le composé chimique est hydrolysé par un mélange d’endonucléase nucléase micrococcique et exonucléase, appelée phosphodiestérase de rate. Le mélange de l’ADN hydrolysée contenant les deux normal (non modifié) et modifié les désoxyribonucléosides monophosphates-3´ réagit avec [γ –³²P] ATP en présence du transporteur (non radioactif) ATP et T4-polynucléotide kinase à pH 9,5 à forme 5´- ³²3´ marquée P, 5´-bisphosphates (procédure « standard » dans la Figure 1). Le pH alcalin utilisé est capable de réduire au minimum l’activité enzymatique du T4-polynucléotide kinase à déphosphorylent désoxyribonucléosides 3´-monophosphates en position 3´. Séparation et résolution de ³²P-étiqueté adduits de désoxynucléotides marqués qui ne sont pas modifiés par des produits chimiques est réalisée par échange d’anions multidirectionnel chromatographie sur couche mince (TLC) POLYÉTHYLÈNEIMINE (PEI), cellulose (Figure 2 ). Dans les étapes de la première et la deuxième d’élution (en direction de D1 et D2), étiqueté normal désoxynucléotides (non modifié), mais aussi [³²P] phosphate est élué dès le début de la plaque de TLC-PEI-cellulose à l’aide de solutions de l’eau de l’électrolyte sur un petit morceau de par chromatographie papier appliqué sur le dessus de la plaque de TLC, tandis que les désoxynucléotides contenant des produits chimiques liés présentant des propriétés hydrophobes (cancérogène/drogue-adduits) sont maintenues au début de plaque PEI-cellulose à être plus résolu avec plusieurs systèmes de solvants différents dans des directions D3 et D4 (Figure 2). Localisation des adduits est effectuée par autoradiographie d’écran amélioré ; adduits le séparés sont détectés comme des taches foncées reconnaissables sur les films radiographiques. Les zones de taches sont excisés de la plaque et permettant de quantifier la radioactivité par scintillation en milieu liquide ou Cerenkov comptage. Un méthode qui a été adapté à la carte et de quantifier l’ADN-images au phosphore stockage adduits sur chromatogrammes détectés par les ³²analyse post-marquage-P est maintenant également utilisé. ¹⁸ machine l’imageur instantanée est fréquemment utilisé pour une détection et quantification de l’ADN des adduits. Cette méthode fournit une sensibilité 10 – fois plus élevée pour la détection de ³²P que la technique de l’écran amélioré autoradiographie¹⁹.

Quantités d’ADN adduits sont déterminés comme valeurs de parent adduit étiquetage (RAL), calculé à l’aide de l’équation (2) comme suit :

CPM. adduit de désoxynucléotides
RAL =—(2)
activité spécifique de ³²P-ATP (au cpm. / pmol) x pmol désoxynucléotides

Les valeurs des RAL sont le ratio du taux de comptage des adduits désoxynucléotides sur les taux de comptage du total [adduits et normal (non modifiées) désoxynucléotides] désoxynucléotides^20,21. Toutefois, ce calcul est fondé sur l’égalité étiquetage efficacités des adduits et désoxynucléotides normal²². La procédure classique (« standard ») des ³²P-post-marquage technique est appropriée pour des adduits d’ADN différents (volumineux et/ou non volumineuses adduits), cependant, sa sensibilité n’est pas satisfaisante pour détecter les adduits trouvés en faibles quantités dans l’ADN. En utilisant cette procédure, le montant d’un adduit dans 10 désoxynucléotides⁷ non modifiés dans l’ADN (0,3 fmol adduit/µg ADN) est détectable.

Une variété de modifications de ce classique ³²P-post-marquage de procédure ont été utilisés pour élever la sensibilité de la technique. Jusqu’à de 10 à 100 fois plus grande sensibilité du dosage des adduits de ³²P-étiquetage a été réalisé en utilisant des niveaux limites de [γ –³²P] ATP (la procédure intensification). ^{23 , 24} une procédure supplémentaire qui prévoie qu’une augmentation de la sensibilité de la méthode de P-post-marquage ³²utilise une incubation de contenant de l’ADN digéré adduits avec la nucléase P1 (à partir de Penicillium citrinum)²¹ (Figure 1). Cette enzyme préfère déphosphorylent désoxyribonucléosides non modifié 3´-monophosphates, tandis que les désoxynucléotides liés produits chimiques (de nucléotides) sont essentiellement pas les substrats de cette enzyme. Par conséquent, désoxyribonucléosides déphosphorylées 3´-monophosphates (c.-à-d., désoxyribonucléosides) ne sont pas phosphorylés par T4-polynucléotide kinase de phosphate [³²P] de γ –³²P] ATP. Toutefois, certains des nucléotides où les produits chimiques sont liés (de désoxynucléotides), tels que les adduits arylamine substitués en C8 de désoxyguanosine, can bedephosphorylated par cette enzyme. En revanche, la plupart des autres adduits (p. ex., adduits substituée au N² de désoxyguanosine) ne sont pas déphosphorylé par nucléase P1. Cette modification de ³²P-post-marquage rend cette méthode beaucoup plus sensibles, augmentant sa sensibilité de plus de trois ordres de grandeur. En outre, cette version de ³²P-post-marquage fournit une méthode où plus des quantités d’ADN (5-10 µg) et un excès de sans porteur ATP [γ – ³²P] peut être utilisé.

Une autre méthode pour enrichir les adduits, décrite par Gupta²⁵, utilise physico-chimiques adduits de propriétés des désoxyribonucléosides volumineux, qui peuvent être extraites en n-butanol en présence d’une phase transfert agent tétrabutylammonium chlorure (TBA) (Figure 1) avant [³²P] phosphate étiquetage, tandis que désoxynucléotides non modifiées sont mal extraites de ce solvant organique. Cependant, moins hydrophobe adduits, composé d’exemple de désoxynucléotides modifié avec non-aromatique moitiés encombrants ou alkyle petit résidus, ne sont pas effectivement extraites avec n-butanol. Par conséquent, ils sont essentiellement indétectable lorsque sont analysés par cette modification des ³²P-post-marquage méthode.

Les versions mentionnées précédemment de ³²P-post-marquage augmentation de la sensibilité et la quantification de l’ADN des adduits énormément (jusqu’à trois ordres de grandeur), être capable de détecter un adduit par 10^9,10 normal les nucléotides (0.3 – 3 amol/µg d’ADN). Ces deux méthodes sont recommandées pour tester les produits chimiques pour leur efficacité à lier par liaison covalente à l’ADN et, par conséquent, elles sont décrites dans cet ouvrage en détails.

Protocol

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux règlements pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (311/1997, ministère de l’Agriculture, République tchèque), qui est en conformité avec la déclaration d’Helsinki. 1. isolement des Fractions de microsomes et cytosoliques hépatiques Préparer les fractions subcellulaires hépatiques (microsomes riches en enzymes P450 ou cytosol riche en réductases ou solubles peroxydases) des rats …

Representative Results

À l’aide de protocoles décrits ici pour l’utilisation de l’activation par catalyse enzymatique (c.-à-d., P450, peroxydase, réductase) pour enquêter sur la puissance des produits chimiques (substances cancérigènes/drogues) pour être métabolisé en intermédiaires, ce qui entraîne leur covalente liaison à l’ADN (génération de l’ADN des adduits), nous avons pu résoudre (i) un nouveau mécanisme de l’action pharmacologique de l’agent anticancéreux ellipti…

Discussion

Dans cet article, il est démontré une méthodologie largement accessible pour étudier l’activité des produits chimiques pour être bioactivated à des intermédiaires métaboliques, aboutissant à la génération de l’ADN covalent des adduits. Il s’agit d’une question cruciale, parce que l’évaluation de la puissance des produits chimiques environnementaux ou de drogues de leur activation enzymatique en métabolites générant ADN covalent adduits est un domaine important dans le développement du cancer et…

Materials

Tris	Sigma-Aldrich	252859
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Phenol	Roth	0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol	Roth	A156.1
Ethanol	Penta	70390-11000
Calf thymus DNA	Sigma-Aldrich	D4522
NADH	Sigma-Aldrich	N7004
NADP+	Sigma-Aldrich	N5755
NADPH	Sigma-Aldrich	N7505
D-glucose 6-phosphate	Sigma-Aldrich	7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase	Sigma-Aldrich	G6378
Supersomes	Corning Gentest	456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes	Corning Gentest	452172
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	77662
2-Hydroxypyrimidine	Sigma-Aldrich	H56800
Ethyl acetate	Sigma-Aldrich	437549
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus	Sigma-Aldrich	N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II	Calbiochem	524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630
Bicine	Sigma-Aldrich	163791
DL-Dithiotreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
Tetrabutylammonium chloride	Sigma-Aldrich	86870
n-Butanol	Sigma-Aldrich	437603
T4-polynucleotide kinase	USB Corp	70031Y
[γ-32P]ATP	Hartman Analytic GmbH	FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates	Macherey-Nagel	801053
Packard Instant Imager A202400	Packard	G120337
Ellipticine	Sigma-Aldrich	285730
3-Nitrobenzanthrone	prepared (synthesized) as shown in ref. 40