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Bioquímica

형성 화학식 DNA Adducts 효소 활성화 된 발암 물질 및 생체 외에서 마약 및 32P postlabeling에 의해 그들의 결정에 의해

Published: March 20, 2018
doi:
10.3791/57177
1Department of Biochemistry,Charles University

Summary

환경 약품 및 중간체 공유 DNA를 생성 하는 bioactivated adducts 효소 수 약물의 효능을 평가 암과 치료의 개발에 중요 한 필드입니다. 메서드는 양식에 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 기술 뿐만 아니라 DNA adducts 복합 활성화에 대 한 설명 합니다.

Abstract

화학식 DNA adducts 화학 물질에 의해 형성 또는 발암 성 힘으로 약물 발암 과정의 개시 단계에서 가장 중요 한 요인의 하나로 판단 됩니다. 이 공유 바인딩 tumorigenesis의 원인으로 간주 됩니다, 이제 화학 발암의 중앙 교리로 평가 됩니다. 여기, 방법을 채용 시 토 크롬 P450 하 여 촉매 반응을 설명 하 고 화학 제품 또는 이러한 DNA를 형성 하는 대사 산물을 그들의 정품 인증에 대 한 약물의 효능을 조사 하기 위해 추가적인 생물학적 효소 adducts. 절차는 생물학적 효소 (microsomal와 cytosolic 샘플 한다 P450 또는 다른 생물학적 효소, 즉, peroxidases, NADPH: 시 토 크롬 P450 보유 세포 분수의 격리를 설명 하 되 게 됩니다. oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase, 또는 세 산화 효소). 방법 설명 또한, 이러한 효소 뿐만 아니라 DNA의 분리에 대 한 분석된 화학 물질의 대사 활성화를 위해 사용할 수 있는. 또한, 적절 한 방법을 감지 하 고 측정 화학/약물 파생 된 DNA adducts, 즉, 32P postlabeling 기술의 다른 수정 및 방사성 분류의 고용, 화학 분석 자세히 표시.

Introduction

환경 화학 물질 (약물) xenobiotics의 물질 대사는 두 단계1에서 발생합니다. 단계 I 및 II 더 친수성 원래 소수 (하지 수용 성) 화합물을 렌더링 하는 것을 목표로 (수용 성), 따라서 소변, 배설물 또는 땀을 통해 쉽게 excretable 그들을 만들기. 단계 (기능화) 반응을 포함 산화, 감소, 및 hydroxylation peroxidases (P450s, CYPs), 시 토 크롬 P450s와 같은 효소에 의해 촉매 (즉,., cyclooxygenase, 콕스), aldo keto reductases (AKRs), 및 microsomal 플 라빈 함유 monooxygenases (FMOs)입니다. 또한 감소 반응, reductases 즉, microsomal NADPH: 시 토 크롬 P450 환 원 효소 (POR) 및 cytosolic NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), 세 산화 효소 (XO), 그리고 알데하이드 산화 효소 (AO)1 의 다양 한에 의해 중재를 포함 하는 단계 . 두 번째 단계 (활용), 단계에 연결 된 기능 그룹에서에서 켤레 극성을 더욱 높이기 위해 작은 극 지 분자를 데 사용 됩니다. 단계 II는 sulfotransferases (SULTs), N, O-acetyltransferases (Nat), methyltransferases catechol-O-methyltransferase (COMT), 티 S-등의 반응에 참여 하는 것으로 간주 하는 효소의 예 transferases (GSTs), 그리고 uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGTs)1. 그러나 단계에서 효소의 분류 I 또는 II는,, 하지 경직 된, 그리고 일부 효소 틀림 없이 어느 범주에 그룹화 할 수 있습니다.

P450 효소 (EC 1.14.14.1) 헤 많은 화학, 그들의 변환3,4catalyzing의 생물학적에 참여, 다양 한 유기 체에 있는 단백질을 포함 하는. P450 효소 촉매 반응 어디 dioxygen의 1 개의 원자에 도입 xenobiotics, 분자 산소의 두 번째 아톰은 2 개의 전자 [방정식 (1 필요로 하는 반응에 의해 양식 물 감소 하는 동안 많은 기판의 hydroxylation )]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → 노 + H2O + NADP+ (1)

P450 효소 포유류 세포 (microsomal P450 시스템)의 바인딩과 그물 막에 더 NADPH: 시 토 크롬 P450 환 원 효소 (POR) 및 시 토 크롬 b5 를 포함 하는 multienzyme monooxygenase 시스템의 구성원 인 NADH: 시 토 크롬 b5 reductase 효소의 기질 되 나. 일반적으로 허용된 이론 hypothesizes P450에 필요한 2 개의 전자의 기증자 NADPH/POR 시스템입니다. 그럼에도 불구 하 고, 시 토 크롬 b5 수 또한 역할 전자의 기증자 P450, 즉의 반응 주기의 두 번째 감소 동안 P450 감소 전자의 기증자로 어디 NADH: 시 토 크롬 b5 와 함께 작동 reductase2,,34.

포유류 활용 다양 한 P450 효소 (예를 들어, 가족 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26, 및 27의 효소) 스테로이드, 같은 귀중 한 내 인 성 화합물의 합성에 놓을 자연 제품2,3 에 대 한 그들을 사용 하 여 . 다른 CYP 포유류 효소, 인간의 CYP1A2, 2C 9, 2C 19 등 2D 6, 및 3A4, 마약으로 사용 되는 외 인 화학 물질 대사. 5 , 6 가장 중요 한 효소 약물의 대사를 catalyzing 3A subfamily, 특히 CYP3A4 CYPs는. 프로-발암 물질 등 프로-유독 xenobiotics의 변환 인간의 CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 및 3A42,5에 의해 중재 됩니다. 이러한 CYPs의 대부분 (CYP1A1 1B1 제외) 간에 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, CYPs는 여러 extrahepatic 장기에도 표현 됩니다. 이러한 P450s 주로 큰 의미의 있을 때 이러한 장기7에서 반응 중간체에 그들은 화학 물질 (약물)의 bioactivation 대사에 참여. 다양 한 P450s는 이것이 반드시 경우 비록 그들의 기질, 여러 화합물에 의해 유도 됩니다.

많은 P450 효소 화학 (마약) 독성에 역할을 재생합니다. 그들은 뿐만 아니라 자신의 해독 대사 산물에는 xenobiotics를 변환할 수 있지만 또한 수정 하는 또한 다른 생물 학적 속성을 일반적으로 그들의 독성을 일으키는 내 생 고분자 반응 종에 그들을 활성화 합니다. DNA, 지질, 및 단백질 반응 electrophiles 및 활성화 된 화학 물질에서 생성 된 래 디 칼에 의해 그들의 수정에 대 한 목표 수 있습니다. DNA의 경우 몇 가지 중요 한 유전자 응답 및 그들의 메커니즘 해결2,3,,45이미 알려져 있습니다.

DNA에 변화 세포 성장 제어, 감소 될 수 있습니다 그리고이 현상이 발암 과정의 개발을 선도 하는 주된 요인이 될 간주 됩니다. 화학식 DNA의 세대 adducts 화학 물질과 발암의 개시 단계에서 가장 중요 한 단계 중 하나는8,9,,1011처리 판단 데 발암 성 힘. 시연 되었다 DNA의 형성 관계 adducts 및 tumorigenesis 발생, 반면 DNA 양을 감소 adducts 자성8,,910, 에 대 한 책임은 11 , 12 , 13 , 14. 발암 물질/의약품 파생의 형성 DNA adducts의 DNA, 개별 기초에 따라 달라 집니다 그리고 DNA에이 기지의 시퀀스에 의해 영향을 받습니다. 수리의 DNA adducts는 그들의 위치 (베낀 또는 비 복사할 DNA 가닥) 및 수정 된 뉴클레오티드 시퀀스8,,1112,15의 종류에 16.

이 문서에서는, 우리 DNA를 수정 하는 대사 산물으로 활성화 될 그들의 힘을 조사 하기 위해 화학 물질 (마약)의 효소 촉매 변환 활용 절차 설명 (생성 하는 DNA adducts). 화학식 DNA 바인딩, 테스트 화합물 일반적으로 해야 개별 약물에 따라 산화 또는 감소 반응에 의해 활성화. 시험 된 화학 물질의 산화 또는 감소 활성화 P450 의존 효소 시스템 microsomal subcellular 분수에 의해 중재 또는 reductases 감소 하 여 microsomes (POR, NADH: 시 토 크롬 b5 에서 모두 환 원 효소, P450 효소)와 셀룰러 cytosolic subcellular 분수 (NQO1, XO, AO, 과산화 효소). 반응 metabolites 그 후 DNA를 바인딩할 adducts DNA를 형성. 산화와 감소 반응 이러한 반응 종에 여러 약물을 활성화 하는 것이 중요 하기 때문에, 산화/환 원 효소 시스템을 채용 하는 실험적인 절차 설명 합니다. 또한, 적절 한 방법을 감지 하 고 측정 이러한 DNA adducts 자세히 설명 되어 있습니다.

테스트 화학 효소 시스템에 의해 활성화 여부를 확인 하기 위해 두 개의 독립적인 절차 DNA에 바인딩되어 권장: 32P postlabeling 기술과 활용 표시 된 방사성 화합물 (예., 3H 또는 14 C). 첫 번째 파일럿, 32P postlabeling 분석 결과 검사 것이 좋습니다. 정확 하 게 평가 하는 솔루션에서 DNA 콘텐츠의 결정 두 가지 방법 모두 붙여야 합니다.

32P postlabeling 기술을 활용 하 여 비 방사성 화학 물질 (발암 물질/의약품) 3´-phosphodeoxynucleosides, 5´-방사성 인 (32P)와 추가 인 산화에 의해 수정 하는 DNA의 효소 가수분해 오 위치, 그리고 화학 deoxynucleotide의 분리 adducts 정상 (수정된) deoxynucleotides에서 크로마토그래피17 (그림 1)에 의해. DNA는 화합물에 의해 수정 endonuclease, micrococcal nuclease 및 비장 포스로 알려진 exonuclease의 혼합물에 의해 분해 됩니다. (수정 되지 않은) 두 정상을 포함 하 고 deoxyribonucleoside 3´-monophosphates 양식 5´- 에 pH 9.5에서 캐리어 (비 방사성) ATP 및 T4 polynucleotide 키 존재 [γ-32P] ATP와 반응 수정 hydrolyzed DNA의 혼합물 32P 표시 된 3´, 5´ bisphosphates (“표준” 절차 그림1에서). 사용 된 알칼리 pH에서 위치 3´ deoxyribonucleoside 3´ monophosphates dephosphorylate를 T4 polynucleotide 키의 효소 활동을 최소화 가능 하다. 분리 및 32의 해상도에서 adducts P 라는 화학 물질에 의해 수정 되지 않은 레이블된 deoxynucleotides multidirectional 음이온 교환 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) polyethyleneimine (페이) 셀 루 로스 (그림 2에 의해 수행 됩니다 ). (D1 및 D2 방향)에서 첫 번째 및 두 번째 차입 단계에서 [32P] 인산 염으로 레이블이 지정 된 정상 (수정된) deoxynucleotides는 eluted의 짧은 조각에 전해질의 물 솔루션을 사용 하 여 TLC 페이 셀 룰 로스 판의 시작에서 컬럼에 종이 전시 (발암 물질/약물-adducts) 소수 성 속성 바인딩된 화학 물질을 포함 하는 deoxynucleotides 또한 해결 해야 페이 셀 룰 로스 판의 시작에 유지 하는 반면 TLC 판 상단에 적용 와 d 3와 d 4 방향 (그림 2)에서 여러 다른 용 매 시스템. 국산화 adducts 화면 향상 autoradiography;를 사용 하 여 수행 분리 adducts x 선 필름에 어두운 인식할 수 있는 반점으로 검색 됩니다. 관광 명소의 지역 접시에서 excised 있으며 액체 섬광 또는 계산 Cerenkov 방사능을 측정 하는 데 사용. 이미징 방법 지도 및 DNA 계량에 적응 된 스토리지 인 adducts chromatograms 감지에 의해 32P postlabeling 분석 결과 지금 또한 사용 됩니다. 18 는 즉시 영상 기계 같은 검색 이용 자주 하 고 DNA의 정량화 adducts. 스크린의 기술 향상 autoradiography19보다 32P를 탐지 하기 위한 보다 10 배 더 높은 감도를 제공 합니다.

양의 DNA adducts의 상대 값 adduct 라벨 (RAL), 방정식 (2)를 사용 하 여 다음과 같이 계산으로 결정 됩니다.

노출 당 비용입니다. 에 deoxynucleotides adduct
RAL =—(2)
32P-ATP의 특정 활동 (cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides

총 [adducted 고 정상 (수정된) deoxynucleotides]의 수 속도 RALs의 값은 adducted deoxynucleotides의 수의 비율 deoxynucleotides20,21. 그러나,이 계산을 기반으로 동등한 adducts의 효율성 라벨 및 일반 deoxynucleotides22. 그러나 다양 한 DNA adducts 32P postlabeling 기술의 고전 (“표준”) 절차는 적절 한 (부피 또는 부피 비 adducts),, 그것의 감도 만족 스러운 감지 하에서 낮은 금액 DNA adducts. 이 절차를 사용 하 여 DNA (0.3 fmol adduct / µ g DNA)에 107 수정 되지 않은 deoxynucleotides에 adduct의 양을 감지입니다.

수정이 클래식 32P postlabeling 절차의 다양 한 기법의 감도 상승 이용 되어 있다. 10-100 배 더 높은 감도의 결정의 최대 32여 adducts P 라벨 달성 되었습니다 [γ-32P] ATP (강화 절차)의 제한 레벨을 사용 하 여. 23 , 24 32P postlabeling 방법의 감도 증가 소화 DNA 포함의 부 화를 활용 하 여 제공 하는 추가 절차 adducts nuclease P1 ( 푸른 곰 팡이 citrinum)에서21 (그림 1)와 함께. 이 효소는 바인딩된 화학 (adducted 뉴클레오티드)와 deoxynucleotides는 기본적으로 하지는 기질이이 효소의 수정 되지 않은 deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, dephosphorylate을 좋아한다. 따라서, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (즉, deoxyribonucleosides)에서 γ-32P [32P] 인산 하 여 T4 polynucleotide 키 니 아 제에 의해 phosphorylated 하지은] ATP. 그러나, 일부 화학 물질은 뉴클레오티드의 (adducted deoxynucleotides), deoxyguanosine,이 효소에 의해 수 bedephosphorylated의 c 8에서와 같은 arylamine adducts 대체. 대조적으로, 대부분 다른 adducts (adducts예를 들어, deoxyguanosine의 N2 에서 대체) nuclease p 1에 의해 dephosphorylated 하지. 32P postlabeling이 수정 게이 방법 상당히 더 민감한, 이상 3 개의 크기 순서에 의해 그것의 감도 증가. 또한,이 버전의 32P postlabeling 메서드를 제공 합니다 어디에 더 높은 양의 DNA (5-10 µ g) 및 캐리어 무료 초과 [γ- 32P] ATP는 이용 될 수 있다.

풍부 하 게 하는 또 다른 방법은 adducts, 굽타25설명 된는 물리를 활용 하 여 부피가 큰 deoxynucleotide의 속성 adducts는 n으로 추출 될 수 있다-단계 전송 에이전트 tetrabutylammonium 존재 butanol [32P] 인산 라벨, 수정 되지 않은 deoxynucleotides는이 유기 용 매 추출 저조한 반면 이전 염화 (미정) (그림 1). 그러나, 적은 소수 adducts, 구성 된 deoxynucleotides의 예 비 향기로운 부피가 moieties 또는 작은 알 킬 잔류물, 수정에 대 한 추출 되지 않습니다 효과적으로 n-butanol. 따라서, 그들은 32P postlabeling 방법의이 수정에 의해 분석 하면 기본적으로 감지 되지 않습니다.

모두 32P postlabeling 증가 감도 DNA의 정량화 adducts 엄청난 (최대 3 개의 크기 순서)의 이전에 언급 한 버전, 109,10 정상 당 adduct 하나를 검색할 수 있게 되 고 뉴클레오티드 (0.3-3 박 / µ g의 DNA). 이러한 두 가지 방법 covalently DNA를 바인딩할 그들의 효율성에 대 한 화학 물질을 테스트 하기 위한 권장 하 고, 따라서, 그들은 세부 사항에서이 작품에 설명 되어 있습니다.

Protocol

모든 동물 실험 관리 및 사용의 실험실 동물 (311/1997, 농림, 체코 공화국), 헬싱키의 선언 준수에 대 한 규정에 따라 수행 했다. 1. 간 Microsomal 및 Cytosolic 분수의 격리 간단한 차동 원심 (105000 x g)에 의해 쥐에서 간 subcellular 분수 (microsomes P450 효소 또는 reductases 또는 수용 성 peroxidases에 풍부한 cytosols 풍부한)을 준비 합니다.참고: 펠 릿과 상쾌한 가져옵니다 microsome…

Representative Results

그들의 공유의 결과로 중간체를 대사에 화학 물질 (발암 물질/약)의 효능을 조사 하 효소 촉매 활성화 (즉, P450, 과산화 효소, reductase)의 활용에 대 한 여기에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 DNA에 바인딩 (세대의 DNA adducts), 우리 (대 한 검토 보고,29,,3031), 항 암 에이전트 ellipticine의 약리 작용의 (i)?…

Discussion

이 논문에서는, 그것은 대사 중간체, 화학식 DNA의 세대에서 발생 하는 bioactivated 것 화학 물질의 효능 연구를 광범위 하 게 액세스할 수 있는 방법론 adducts 시연입니다. 이것은 중요 한 문제, 환경 화학 물질의 힘 이나 공유 DNA를 생성 하는 대사 산물을 그들의 효소 활성의 약물의 평가 adducts 때문에 암과 치료의 개발에 중요 한 필드입니다. 종양 개발의 원인으로 간주 하는 발암 물질에 의해 DNA의 수?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 체코 과학 재단 (GACR, 그랜트 17-12816S)에 의해 지원 되었다.

Materials

Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40
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Referências

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Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).
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