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Bioquímica

Formazione di covalente del DNA addotti da agenti cancerogeni enzimaticamente attivati e farmaci In Vitro e la loro determinazione di 32P-postlabeling

Published: March 20, 2018
doi:
10.3791/57177
1Department of Biochemistry,Charles University

Summary

Valutare la potenza dei prodotti chimici ambientali e farmaci, per essere enzimaticamente addotti bioactivated per intermedi generando covalente del DNA, è un campo importante nello sviluppo del cancro ed il relativo trattamento. Metodi sono descritti per l’attivazione di composto per formare che complessi del DNA, così come le tecniche per la loro rilevazione e quantificazione.

Abstract

Complessi covalenti del DNA formata da sostanze chimiche o farmaci con potenza cancerogena sono giudicati come uno dei fattori più importanti nella fase di inizio di processi cancerogeni. Questo legame covalente, che è considerata la causa della tumorigenesi, ora viene valutato come un dogma centrale della carcinogenesi chimica. Qui vengono descritti metodi che impiegano le reazioni catalizzate dal citocromo P450 e gli enzimi di biotrasformazione aggiuntive per indagare la potenza di sostanze chimiche o farmaci per la loro attivazione ai metaboliti che formano questi DNA addotti. Le procedure sono presentate che descrive l’isolamento delle frazioni cellulari che possiedono enzimi di biotrasformazione (campioni microsomiali e citosolici con citocromi P450 o altri enzimi di biotrasformazione, vale a dire, perossidasi, NADPH: citocromo P450 ossidoriduttasi, NAD (P) h: ossidoriduttasi o xantina ossidasi). Inoltre, vengono descritti metodi che può essere utilizzato per l’attivazione metabolica delle sostanze chimiche analizzate da questi enzimi come pure quelli per isolamento di DNA. Inoltre, i metodi appropriati in grado di rilevare e quantificare il DNA derivato chimico/droga addotti, cioè, diverse modifiche della tecnica P-postlabeling 32e occupazione di radioattivo etichettato analizzati prodotti chimici, sono indicato nel dettaglio.

Introduction

Il metabolismo degli xenobiotici (sostanze chimiche ambientali o farmaci) si verifica in due fasi1. Fasi I e II mirano a rendere i composti originariamente idrofobici (non solubili in acqua) più idrofila (solubile in acqua), rendendoli così facilmente excretable tramite urine, feci e sudore. Fase I (funzionalizzazione) reazioni comprendono l’ossidazione, riduzione, e idrossilazione catalizzata da enzimi come la citocromo P450s (P450s, CYPs), perossidasi (cioè., ciclossigenasi, COX), aldo-cheto riduttasi (AKRs) e microsomico monossigenasi contenente flavina (protocolli). Fase I comprende anche reazioni di riduzione, mediate da una varietà di riduttasi cioè microsomico NADPH: citocromo P450 reduttasi (POR) e citosolica NAD (P) h: ossidoriduttasi (NQO1), xantina ossidasi (XO) e aldeide ossidasi (AO)1 . Nella seconda fase (coniugazione), i gruppi funzionali che sono stati fissati nella fase I sono utilizzati a coniugare piccole molecole polari per aumentare ulteriormente la polarità. Esempi di enzimi che intende partecipare alla reazione di fase II sono sulfotransferasi (SULTs), N, O– acetiltransferasi (NAT), methyltransferases come catecolo –O– metiltransferasi (COMT), glutatione S– transferasi (GSTs) e uridina difosfato glucuronosiltransferasi (UGT)1. La classificazione degli enzimi di fase I o II è, tuttavia, non rigidi, e alcuni enzimi probabilmente possono essere raggruppati in due categorie.

Gli enzimi P450 (EC 1.14.14.1) sono l’eme contenente proteine presenti in vari organismi, che sono implicate nella biotrasformazione di molte sostanze chimiche, che catalizza la loro conversione3,4. Gli enzimi P450 catalizzano idrossilazione di molti substrati, con una reazione in cui un atomo di ossigeno è introdotta nella molecola degli xenobiotici, mentre il secondo atomo di ossigeno è ridotto per formare acqua dalla reazione che richiede due elettroni [l’equazione (1 )]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH +H2O+ NADP+ (1)

Gli enzimi P450 localizzati sulla membrana del reticolo endoplasmatico delle cellule di mammiferi (sistemi di P450 microsomici) sono membri del sistema multienzimatico monoossigenasi, che contiene ulteriormente riduttasi NADPH: citocromo P450 (POR) e citocromo b5 , il substrato dell’enzima definito come NADH: citocromo b5 reduttasi. Una generalmente accettata la teoria ipotizza che il donatore dei due elettroni necessari per P450 è il sistema di NADPH/POR. Tuttavia, citocromo b5 potrebbe anche agire come un donatore di elettroni per P450, vale a dire come un donatore dell’elettrone riducendo P450 durante la seconda riduzione del suo ciclo di reazione, dove agisce insieme al NADH: citocromo b5 reduttasi2,3,4.

Mammiferi utilizzano vari enzimi P450 (ad esempio, gli enzimi delle famiglie 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 e 27) per la sintesi di importanti composti endogeni, quali gli steroidi e li usa per il catabolismo di prodotti naturali2,3 . Gli altri enzimi CYP mammiferi, come ad esempio umano CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 e 3A4, metabolizzare prodotti chimici esogeni che sono utilizzati come farmaci. 5 , 6 gli enzimi più importanti che catalizza il metabolismo dei farmaci sono CYPs della sottofamiglia 3A, soprattutto CYP3A4. Le conversioni degli xenobiotici, quali pro-cancerogeni e pro-sostanze tossiche, sono mediate da umano CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 e 3A42,5. La maggior parte di questi CYPs sono presente nel fegato (eccetto CYP1A1 e 1B1). Tuttavia, il CYPs sono espressi anche in parecchi organi extraepatici. Tali P450s potrebbe essere di grande importanza, soprattutto quando essi partecipano bioactivation metabolismo delle sostanze chimiche (farmaci) per intermedi reattivi in questi organi7. P450s vari sono indotte da diversi composti che sono loro substrati, anche se questo non è necessariamente il caso.

Molti enzimi P450 giocano un ruolo nella tossicità chimica (droga). Possono convertire i xenobiotici non solo in loro metaboliti di disintossicazione, ma anche attivarli a specie reattive, che modificare macromolecole endogene che inoltre presentano diverse proprietà biologiche, causando spesso la loro tossicità. DNA, lipidi e proteine potrebbero essere gli obiettivi per la loro modificazione di reattivi elettrofili e radicali generati dai prodotti chimici attivati. Nel caso del DNA, risolvendo parecchie risposte gene importante ed i loro meccanismi sono già noti2,3,4,5.

I cambiamenti nel DNA possono provocare una diminuzione nel controllo della crescita cellulare, e questo fenomeno è considerato come il fattore predominante che conducono allo sviluppo di processi cancerogeni. La generazione di covalente del DNA addotti con prodotti chimici avendo potenza cancerogena è giudicato come uno dei passi più importanti nella fase di inizio di cancerogeni elabora8,9,10,11. È stato dimostrato che le relazioni tra la formazione di DNA addotti e tumorigenesi verificarsi, mentre una diminuzione della quantità di DNA addotti è responsabile di chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. la formazione di cancerogeno o droga-derivati complessi del DNA dipende dalle singole basi di DNA ed è influenzata dalle sequenze di queste basi nel DNA. Le riparazioni del DNA addotti dipendono dalla loro posizione (sul filo del DNA trascritto o non trascritto) e tipi di nucleotidi modificati sequenze8,11,12,15, 16.

In questo articolo, descriviamo le procedure che utilizzano la conversione enzima-catalizzate di sostanze chimiche (farmaci) per indagare la loro potenza deve essere attivato in metaboliti che modificati del DNA (DNA di generazione addotti). Per legame covalente del DNA, di solito composto in esame dovrebbe essere attivato sia da reazioni ossidativa o riduttive, a seconda delle diverse droghe. Ossidativo o riduttiva l’attivazione dei prodotti chimici testati è mediata da un sistema enzimatico P450-dipendente presente nella frazione microsomica del subcellulare o tramite riduzione con riduttasi presente sia nei microsomi (POR, NADH: citocromo b5 reduttasi, enzimi P450) e in frazioni subcellulari citosoliche cellulari (NQO1, XO, AO, perossidasi). Metaboliti reattivi da allora in poi si legano al DNA che formano il DNA addotti. Perché sia ossidativa e riduttive le reazioni sono importanti per attivare parecchie droghe per queste specie reattive, sono descritte le procedure sperimentali che impiegano il sistema enzimatico di ossidazione/riduzione. Inoltre, i metodi appropriati in grado di rilevare e quantificare questi DNA addotti sono descritte in dettaglio.

Due procedure indipendenti per determinare se la sostanza chimica, attivato da sistemi enzimatici, è associato al DNA sono raccomandati: 32P-postlabeling tecnica e che utilizzano composto radioattivo etichettato (ad es., 3H o 14 C). Per il primo pilota, 32P-postlabeling test di screening è raccomandato. La determinazione del contenuto di DNA nelle soluzioni, precisamente valutata, deve precedere entrambi i metodi.

32P-postlabeling tecnica utilizza l’idrolisi enzimatica del DNA modificato da sostanze chimiche non radioattivo (cancerogeno/droga) a 3 ´-phosphodeoxynucleosides, ulteriore fosforilazione con fosforo radioattivo (32P) a 5 minuti- OH posizione e la separazione del prodotto chimico-deossinucleotidi addotti dal normale deossinucleotidi (non modificato) da cromatografia17 (Figura 1). DNA modificato dal composto chimico è idrolizzato da una miscela di endonucleasi, nucleasi di micrococcal ed esonucleasi, noto come milza fosfodiesterasi. La miscela di DNA idrolizzato contenente sia normale (non modificato) e modificato desossiribonucleosidi 3 ´-monofosfati sono reagito con [γ –32P] ATP in presenza di elemento portante (non radioattivo) ATP e T4 polinucleotide chinasi a pH 9,5 per modulo 5 ´- 32P-labeled 3 ´, a 5 minuti-bisphosphates (procedura “standard” nella Figura 1). Il pH alcalino utilizzato è in grado di ridurre al minimo l’attività enzimatica della chinasi di polinucleotide T4 a dephosphorylate desossiribonucleosidi 3 ´-monofosfati in posizione 3 ´. Separazione e risoluzione di 32P-labeled addotti da deossinucleotidi con etichetta che non vengono modificati da sostanze chimiche avviene mediante cromatografia su strato sottile di scambio anionico multidirezionale (TLC) su polyethyleneimine (PEI) cellulosa (Figura 2 ). Nei passaggi di eluizione prima e la seconda (in direzione di D1 e D2), con etichetta normale deossinucleotidi (non modificato), come pure [32P] fosfato è eluito fin dall’inizio della piastra TLC-PEI-cellulosa utilizzando soluzioni di acqua dell’elettrolita su un breve pezzo di carta cromatografica applicato sulla parte superiore della piastra di TLC, considerando che i desossinucleotidi contenenti prodotti chimici associati che esibiscono proprietà idrofobe (cancerogeno/droga-addotti) sono tenute all’inizio della piastra di PEI-cellulosa per essere inoltre risolto con vari sistemi solvente nelle direzioni D3 e D4 (Figura 2). Localizzazione di addotti viene eseguita mediante autoradiografia schermo migliorato; addotti i separati vengono rilevati come macchie scure riconoscibili sulle pellicole di raggi x. Le aree di macchie sono asportate dalla piastra e utilizzate per quantificare la radioattività da scintillazione liquida o Cerenkov contando. Un fosforo di deposito metodo che è stato adattato per mappare e quantificare il DNA di imaging addotti su cromatogrammi rilevati da 32P-postlabeling analisi ora è anche usata. 18 macchina the Instant Imager è spesso utilizzato per tale rilevazione e quantificazione del DNA addotti. Questo metodo fornisce più di 10 volte maggiore sensibilità per rilevazione 32P che la tecnica dello schermo migliorato autoradiografia19.

Quantità di DNA addotti sono determinati come valori di parente adducono etichettatura (RAL), calcolata utilizzando l’equazione (2) come segue:

CPM. addotto in deossinucleotidi
RAL =—(2)
attività specifica di 32P-ATP (in cpm. / pmol) x pmol deossinucleotidi

I valori di RAL sono il rapporto dei tassi totali di desossinucleotidi pollici addotti sopra i tassi di conteggio del totale [pollici addotti e normale (non modificato) deossinucleotidi] deossinucleotidi20,21. Tuttavia, questo calcolo si basa sulla parità etichettatura efficienze di addotti e normale deossinucleotidi22. La procedura classica (“standard”) del 32P-postlabeling tecnica è adatta per vari DNA adduce (ingombranti e/o non ingombranti addotti), tuttavia, la sua sensibilità non è soddisfacente per rilevare addotti trovato in basse quantità nel DNA. Utilizzando questa procedura, la quantità di un addotto in 107 invariato deossinucleotidi nel DNA (0,3 fmol addotto / µ g del DNA) è rilevabile.

Una varietà di modifiche di questa classica 32P-postlabeling procedura sono stati utilizzati per elevare la sensibilità della tecnica. Fino a 10-100 volte maggiore sensibilità della determinazione degli addotti da 32P-etichettatura è stato raggiunto utilizzando limitando i livelli di ATP [γ –32P] (la procedura di intensificazione). 23 , 24 un’ulteriore procedura fornendo che un aumento della sensibilità del metodo 32P-postlabeling utilizza un’incubazione contenente DNA digerito addotti con nucleasi P1 (da Penicillium citrinum)21 (Figura 1). Questo enzima preferisce dephosphorylate desossiribonucleosidi non modificato 3 ´-monofosfati, considerando che i desossinucleotidi con prodotti chimici associati (pollici addotti nucleotidi) sono essenzialmente non i substrati di questo enzima. Pertanto, trifosfati defosforilata 3 ´-monofosfati (cioè, desossiribonucleosidi) non sono fosforilati da chinasi di polinucleotide T4 dal fosfato [32P] da γ –32P] ATP. Tuttavia, alcuni di nucleotidi dove i prodotti chimici sono vincolati (pollici addotti deossinucleotidi), come arylamine addotti sostituito a C8 della deossiguanosina, può bedephosphorylated da questo enzima. Al contrario, la maggior parte altri addotti (ad es., addotti sostituito al N2 di deossiguanosina) non sono defosforilata di nucleasi P1. Questa modifica di 32P-postlabeling rende questo metodo notevolmente più sensibile, aumentando la sua sensibilità di più di tre ordini di grandezza. Inoltre, questa versione di 32P-postlabeling fornisce un metodo dove maggiore quantità di DNA (5-10 µ g) e un eccesso di carrier-gratuita ATP [γ – 32P] può essere utilizzato.

Un altro metodo per arricchire l’addotti, descritto da Gupta25, utilizza il fisico-chimiche proprietà di deossinucleotidi ingombranti addotti, che può essere estratto in n-butanolo in presenza di una fase trasferimento agente tetrabutilammonio cloruro (TBA) (Figura 1) prima del [32P] fosfato etichettatura, considerando che non modificati deossinucleotidi sono scarsamente estratte da questo solvente organico. Tuttavia, meno idrofobo addotti, consistente per esempio di desossinucleotidi modificato con moiety ingombranti non aromatici o alchil piccoli residui, non sono effettivamente estratti con n-butanolo. Perciò, essi sono essenzialmente non rilevabile quando vengono analizzati da questa modifica di 32P-postlabeling metodo.

Entrambe le versioni precedentemente accennate di 32P-postlabeling aumento la sensibilità e la quantificazione di DNA addotti enormemente (fino a tre ordini di grandezza), essendo in grado di rilevare uno del complesso ogni 109,10 normale nucleotidi (0,3 – 3 amol / µ g del DNA). Questi due metodi sono raccomandati test chimici per la loro efficienza legare covalentemente al DNA e, di conseguenza, essi sono descritti in questo lavoro nei dettagli.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con i regolamenti per la cura e l’uso di animali da laboratorio (311/1997, Ministero dell’agricoltura, Repubblica Ceca), che è in conformità con la dichiarazione di Helsinki. 1. isolamento delle frazioni microsomiche e citosoliche epatiche Preparare le frazioni subcellulari epatiche (microsomi ricchi di enzimi P450 o citosol ricco di riduttasi o solubile perossidasi) dai ratti tramite centrifugazione differenzia…

Representative Results

Utilizzando i protocolli descritti qui per l’utilizzo dell’enzima-catalizzate attivazione (cioè, P450, perossidasi, reduttasi) per indagare la potenza dei prodotti chimici (sostanze cancerogene/droghe) per essere metabolizzato a intermedi conseguente loro covalente associazione a DNA (generazione del DNA addotti), siamo stati in grado di risolvere (i) un nuovo meccanismo dell’azione farmacologica di ellipticine l’agente anticancro (per vedere recensione,29</sup…

Discussion

In questa carta, è dimostrato una metodologia ampiamente accessibile per studiare la potenza dei prodotti chimici bioactivated per intermedi metabolici, con conseguente generazione di covalente del DNA di essere addotti. Questo è un tema cruciale, perché valutazione delle droghe della loro attivazione enzimatica a metaboliti generando covalente del DNA o la potenza dei prodotti chimici ambientali complessi è un campo importante nello sviluppo del cancro ed il relativo trattamento. La modifica del DNA dagli agenti can…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto da Fondazione ceca per la scienza (GACR, grant 17-12816S).

Materials

Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40
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Referências

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Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).
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