Protocole d’isolement de cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes de souris et leur Activation ultérieure In Vitro avec tumeur Complexes immuns
Summary
Macrophages dérivés de monocytes DC (RCSCND) peut détecter de petites quantités de molécules associées à risque et sont donc facilement apprêté. Nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement des RCSCND de sang et de tumeurs et de leur mise en route avec les complexes immuns tout en soulignant des précautions qui doivent être menées afin d’éviter leur activation prématurée.
Abstract
Les cellules dendritiques (DC) sont des populations de cellules hétérogènes qui diffèrent dans leur membrane cellulaire marqueurs, migratoires et leur distribution, ainsi que dans leur présentation de l’antigène et les capacités d’activation des lymphocytes T. Puisque les vaccins la plupart des modèles de tumeurs expérimentales nécessitent des millions de DC, ils sont largement isolés de la moelle osseuse ou de la rate. Cependant, ces DC diffèrent sensiblement du sang et tumeur DC dans leurs réponses à complexes immuns (IC) et probablement d’autres récepteurs couplés Syk lectine. Important, étant donné la sensibilité de la DC aux molécules associées à risque, la présence d’endotoxines ou anticorps récepteurs activation crosslink dans l’un de l’isoler les étapes pourrait entraîner l’amorçage du DC et ainsi influer sur les paramètres, ou du moins la dosage, pour les activer. Par conséquent, nous décrivons ici un protocole détaillé pour isoler le RCSCND de sang et les tumeurs tout en évitant leur activation prématurée. En outre, un protocole est fourni pour l’activation de RCSCND avec tumeur IC et leurs analyses subséquentes.
Introduction
Depuis leur découverte, les cellules dendritiques (DC) ont été au centre de recherches approfondies en raison de leur capacité unique à biaiser la différenciation des cellules de T1. Depuis les dernières décennies, un effort de recherche approfondie a cherché à définir les divers sous-ensembles de DC et de leur fonction au cours de la progression tumorale et immunité 2. Contrôleurs de domaine sont composés de populations de cellules hétérogènes qui ne diffèrent les uns des autres sur leurs récepteurs de reconnaissance de motifs, distribution tissulaire, et migrateurs et antigène présentation fonctionnalités3,4,5. Par rapport aux autres sous-ensembles de DC, DC macrophages dérivés de monocytes (RCSCND) sont beaucoup plus abondant dans les tumeurs et peut être facilement généré de circulation ou tumeur-infiltrant monocytes,6,,7. Par conséquent, plusieurs essais cliniques, qui cherchent à tirer profit de leur prévalence relative reposent sur manipulation in vivo et ex vivo de RCSCND autologue pour obtenir des cellules T immunitaires 8,9.
De même, vaccination DC basé sur des modèles expérimentaux de tumeur nécessite des injections séries 2-3, 5-7 jours d’intervalle, de 1-2 x 106 activé DC pulsé avec des antigènes de la tumeur. Par conséquent, pour atteindre ce grand nombre de DC, la plupart des études de souris ont principalement utilisé RCSCND pendant 7 à 9 jours (IL-4 n’est pas nécessaire dans le cadre de la souris) d’échantillons de précurseurs de la moelle osseuse (BM) dans le GM-CSF10,11. Néanmoins, compte tenu de cette knockout de GM-CSF souris ont globalement normal DC compartiment 12,13et les populations mixtes issues de cette culture,14 la pertinence physiologique de ces DC a été remise en question.
Alternativement, DC peut être systématiquement isolé des cellules de rate. Toutefois, DC ne comprendre qu’environ 0,3 à 0,8 % des cellules de la rate total (soit environ 7 x 105 DC/rate) et de ces cellules, seulement CD103+ DC et RCSCND peuvent migrer vers les organes lymphoïdes. Puisque MoDCs représentent environ 10 à 15 % des splénique DC populations15,16, la plupart des protocoles d’isolement donnent environ 1 x 105 RCSCND par rate. Extension de RCSCND est possible en injectant des cellules transfectées B16 qui sécrètent le GM-CSF, résultant en une augmentation de 100 fois dans la rate RCSCND17. Cependant, l’utilisation de RCSCND pour le développement de vaccins DC est limitée étant donné que cette procédure ne peut se faire chez l’homme et obtenus RCSCND sont déjà fortement activés.
En plus d’obtenir un nombre suffisant de DC, un autre défi pour le développement de vaccins DC efficaces contre les cellules cancéreuses autologue implique l’absence de signaux de danger suffisant dans le cadre de la tumeur pour activer complètement DC. Induction de signaux de costimulation est habituellement obtenue grâce à l’activation des récepteurs de reconnaissance de motifs (PRR), ou lectine de type c signalisation voies18,19,20,21. Une autre approche pour l’activation de DC exploite leur capacité à relever les antigènes grâce à des interactions avec des récepteurs Fcγ de surface (FcγR). En effet, un certain nombre de manuscrits importants ont montré que l’injection de RCSCND de précurseurs de BM activé avec la tumeur-IgG IC peut empêcher la croissance de la tumeur dans paramètres prophylactiques et peut conduire à l’éradication des tumeurs établies22,23 .
Dans deux articles récents, Carmi et coll. a découvert que, contrairement aux BMDC et rate DC, RCSCND du sang et les tumeurs ne peut répondre à IgG IC sans stimuli additionnels. Cela s’est avéré pour être due à la présence de haut niveau intracellulaire de tyrosines phosphatases réglementer FcγR signalisation24,25. En définissant un point de contrôle critique dans DC, ce travail a fourni un aperçu important sur les exigences relatives à la vaccination de base DC réussie. L’exigence pour des stimuli additionnels permettre FcγR signalisation et signalisation sans doute d’autres récepteurs de lectine utilisant une cascade de phosphorylation similaires, donc souligne la nécessité pour éviter les désamorçages DC pendant leur isolement.
Par conséquent, le présent protocole décrit l’isolement des RCSCND de sang et les tumeurs, qui diffèrent nettement de la BM et de la rate DC, et met en évidence les précautions à envisager au cours du processus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vu le grand nombre de DC requis pour la vaccination de souris (environ 2-4 x 106 DC par une souris), la plupart de la vaccination stratégies chez les souris reposent sur l’isolement des DC de la BM et de la rate, suivie de leur activation ex vivo . Cependant, tente d’activer tumeur DC in vivo, en utilisant les mêmes conditions pour l’activation de la rate et BM DC, ont souvent échoué à produire une immunité efficace. Dans deux publications ultérieures, Carmi et al. ont t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
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