Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe
Summary
Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.
Abstract
Dendritische Zellen (DC) sind heterogene Zell-Populationen, die sich in ihrer Zellmembran Marker, Migrationsmuster und Verteilung, und in ihrer Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierung-Kapazitäten zu unterscheiden. Da die meisten Impfungen der experimentellen Tumormodellen Millionen von DC benötigen, sind sie weitgehend isoliert aus dem Knochenmark oder Milz. Diese DC deutlich unterscheiden sich jedoch von Blut und Tumor DC in ihren Antworten zu Immunkomplexe (IC) und vermutlich andere Lektin Syk-gekoppelten Rezeptoren. Wichtig ist, angesichts der Sensibilität der DC in Gefahr-assoziierter Moleküle, das Vorhandensein von Endotoxinen oder Antikörper, die Crosslink-Aktivierung-Rezeptoren in der Isolierung eines Schritte könnte führen die Grundierung von DC und beeinträchtigen somit die Parameter oder zumindest die Dosierung, erforderlich, um sie zu aktivieren. Daher beschreiben wir hier ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren unter Vermeidung der vorzeitigen Aktivierungs. Darüber hinaus ist ein Protokoll für MoDC Aktivierung mit Tumor IC und ihre späteren Analysen bereitgestellt.
Introduction
Seit ihrer Entdeckung wurden die Dendritische Zellen (DC) ein Schwerpunkt der umfangreichen Forschung aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit, T-Zell-Differenzierung1verzerren. In den letzten Jahrzehnten hat eine umfangreiche Forschungsarbeit versucht, die verschiedenen DC-Subsets und ihre Funktion während der Tumorprogression und Immunität 2definieren. DCs bestehen aus heterogenen Zell-Populationen, die in ihre Mustererkennung Rezeptoren, Gewebeverteilung, voneinander unterscheiden und wandernden und Antigen Präsentation Fähigkeiten3,4,5. Im Vergleich zu anderen DC-Teilmengen, Monocyte abgeleitet DC (MoDC) sind weit häufiger in Tumoren und können leicht von zirkulierenden erzeugt werden oder Tumor infiltrieren Monozyten6,7. Viele klinische Studien, die versuchen, ihre relative Prävalenz nutzen basieren daher auf in Vivo und ex Vivo Manipulation von autologen MoDC um T-Zell Immunität 8,9zu entlocken.
In ähnlicher Weise, DC-basierte Impfung von experimentellen Tumormodellen erfordert 2-3 serielle Injektionen, 5-7 Tage auseinander, von 1-2 x 106 aktivierte DC mit Tumorantigenen gepulst. Daher, um diese große Anzahl von DC zu erreichen, die meisten Studien an Mäusen haben in erster Linie verwendet MoDC kultiviert aus dem Knochenmark (BM) Vorstufen in GM-CSF für 7-9 Tage (IL-4 ist nicht erforderlich, in die Maus Einstellung)10,11. Dennoch hat angesichts dieser GM-CSF-Knockout Mäuse haben insgesamt normale DC Abteil 12,13, und die gemischte Bevölkerung aus dieser Kultur gewonnen14 die physiologische Relevanz dieser DC infrage gestellt worden.
Alternativ kann DC von milzzellen routinemäßig isoliert sein. DC umfassen jedoch nur etwa 0,3-0,8 % der gesamten milzzellen (was ca. 7 x 105 DC/Milz), und dieser Zellen, nur CD103+ DC und MoDC können zurück zu den lymphatischen Organen migrieren. Da MoDCs etwa 10-15 % der Milz DC Bevölkerung15,16 umfassen, liefern die meisten Isolierung Protokolle ca. 1 x 105 MoDC pro Milz. Ausbau der MoDC kann erreicht werden, durch die Injektion von transfizierten B16 Zellen, die GM-CSF, was zu einem 100-fold Anstieg in Milz MoDC17absondern. Die Verwendung von MoDC für die Entwicklung von DC Impfstoffe ist jedoch begrenzt, da dieses Verfahren bei Menschen und den erzielten erfolgen kann nicht MoDC sind bereits in hohem Maße aktiviert.
Eine weitere Herausforderung für die Entwicklung von effektiven DC Impfstoffe gegen autologe Krebszellen umfasst neben Erlangung ausreichender Anzahl der DC, den Mangel an ausreichend Gefahrensignale in der Tumor-Einstellung DC voll zu aktivieren. Induktion von co-stimulatory Signalen erfolgt in der Regel durch Aktivierung von Mustererkennung Rezeptoren (PRR), oder c-Art Lectin Signalisierung Wege18,19,20,21. Ein weiterer Ansatz zur Aktivierung DC nutzt ihre Fähigkeit zu nehmen Antigene durch Interaktionen mit Oberfläche Fcγ Rezeptoren (FcγR). In der Tat eine Reihe von wichtigen Handschriften haben gezeigt, dass die Injektion von MoDC aus BM Vorstufen aktiviert mit Tumor-IgG IC Tumorwachstum bei prophylaktischen Einstellungen verhindern können, und führt zur Beseitigung der etablierten Tumoren22,23 .
In zwei Publikationen entdeckt Carmi Et Al. , dass im Gegensatz zu BMDC und Milz DC, MoDC aus dem Blut und Tumoren auf IgG IC ohne zusätzliche Reize reagieren kann. Dies erwies sich durch die Anwesenheit der hohen intrazellulären Tyrosin-Phosphatasen Regulierung Signal24,25FcγR. Definieren Sie einen kritischen Kontrollpunkt in DC, versehen diese Arbeit einen wichtigen Einblick in die Anforderungen an erfolgreiche DC-basierte Impfung. Die Voraussetzung für zusätzliche Reize ermöglichen FcγR Signal- und vermutlich Signalisierung von anderen Lektin-Rezeptoren, die unter Verwendung einer ähnlichen Phosphorylierung Kaskade, unterstreicht damit die Notwendigkeit für die Grundierung von DC während ihrer Isolation zu vermeiden.
Daher dieses Protokoll beschreibt die Isolierung des MoDC von Blut und Tumoren, die sich deutlich von BM und Milz DC unterscheiden, und vorsorgenormen während des Prozesses eine Überlegung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angesichts der großen Zahl von DC erforderlich für die Impfung Mäuse (ca. 2-4 x 106 DC pro Mausklick), die meisten von der Impfung Strategien bei Mäusen auf Isolierung der DC vom BM und Milz basieren, gefolgt von ihrer ex-Vivo -Aktivierung. Allerdings versucht, Tumor DC in Vivo, mit den gleichen Bedingungen zur Aktivierung der Milz und BM DC aktivieren, oft in der Herstellung von wirksamen Immunität unterlegen. In zwei weiteren Publikationen Carmi Et Al. habe festgestellt, dass …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Keine
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
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