Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별
Summary
위성 세포의 정확한 식별 다양 한 생리 및 병 적인 조건 하에서 그들의 기능을 공부 하는 것이 필수적입니다. 이 문서는 얼룩 면역 형광 기반으로 성인 골격 근육 섹션에 위성 셀을 식별 하는 프로토콜을 제공 합니다.
Abstract
면역 형광 검사 조직 섹션에 다른 세포 유형을 식별 하는 데 도움이 효과적인 방법입니다. 원하는 셀 인구를 공부 하기 위하여 특정 셀 표식에 대 한 항 체는 조직 섹션에 적용 됩니다. 성인 골격 근육 인공위성 세포 (SCs)는 근육 수리 및 재생에 기여 하는 줄기 세포 이다. 따라서, 그것은 시각화 하 고 다른 생리 적인 조건 하에서 위성 세포 인구를 추적 하는 것이 중요입니다. 골격 근육을 휴식, SCs 기저 lamina 및 myofiber 플라즈마 멤브레인 사이 상주 합니다. SCs는 myofibers 또는 세포 배양에서 식별 하는 데 일반적으로 사용 되 마커 Pax7 짝된 상자 단백질입니다. 이 문서에서는, 골격 근육 부분에 최적화 된 Pax7 면역 형광 검사 프로토콜은 일반적인 얼룩 및 백그라운드를 최소화 하 여. 기저 lamina의 단백질 (laminin)를 인식 하는 또 다른 항 체도 SCs 유사한 프로토콜을 식별 하는 데 사용할 수 있습니다 또한 더블 또는 트리플 Pax7 및 관심사의 추가적인 단백질을 위한 항 체와 라벨을 수행 하기 위해 추가 되었다.
Introduction
골격 근육 multinucleated 근육 세포의 구성, myotubes 이라고, myofibers, 힘 및 수 축을 통해 움직임을 생성 하는 구성. Craniofacial 일부 근육을 제외 하면 대부분 골격 근육 somite1라고 하는 임시 미 발달 구조에서 파생 됩니다. 조직적 전조 세포 상피 somite myoblasts 될에서 delaminate. 더 Myoblasts myocytes 멀티 nucleated myofibers를 myotubes 될 융합으로 구분 합니다. 위의 과정은 myogenesis 이라고 불리고 일시적으로 통제 제어 유전자 발현의 특징 이다. 조직적 선구자 표현할 Pax3 Pax7, 반면 myoblasts 익스프레스 MyoD 또는 Myf5 myocytes 익스프레스 myogenin myosins2,3. 근육 성장 있는 myofibers 될 큰 근육 섬유 크기 (비 대)4증가 기존 섬유 (증식)에 더 많은 myonuclei를 통합 하는 프로세스입니다. 근육 성장, 동안 줄기 세포 속성을 차별화 하 고 자기 갱신 수에 있는 조직적 셀의 지속 가능한 소스가입니다. 이 세포는 위성 세포 sarcolemma는 myofiber의 (세포 막)와 기저 lamina5사이 그들의 물리적 위치에 따라 불린다. SCs는 적극적으로 청소년 단계 (출생 후 쥐의 첫 2-3 주), 근육 성장에 기여 하지만 성인 근육6휴식에서 무부하 될. 놀랍게도, 그들은 근육에 다시 활성화 될 수 있습니다 손상 및 복구 손상 된 근육7새로운 근육 세포로 분화.
줄기 세포 속성 기본 근육 생물학 및 근육 질환8의 치료에 대 한 관련 SCs의 연구를 확인합니다. 결과적으로, 그것은 과거 십 년간에서 강렬한 수 사의 영역 되었습니다. 유전학 그리고 epigenetics SCs9,10의 해 부에 엄청난 진행이 했다. 분리 하 고 제자리에 SCs 식별에 관련 된 기술은 개발 하 고 방법11에 따라 최적화 된 했다. Immunofluorescent 얼룩 Pax7를 포함 하 여 특정 항 체를 사용 하 여 SCs의 식별 수 있습니다. 그러나, 부족 및 강한 자동-형광 성인 골격 근육 조직을 결합 하는 SCs의 작은 크기 렌더링 시각화 도전. 여기, 우리는 immunofluorescent 얼룩 프로토콜 Pax7 마우스 근육 조직에 대 한 최적화 및 zebrafish 근육12는 기존 방법에 따라 설명 합니다. 또한, 뚜렷한 fluorophore 표시 Laminin 항 체 기저 lamina는 SCs는 위치를 식별 하기 위해 채택 된다. 이 프로토콜은 지속적으로 Pax7 긍정적인 SCs와 모든 테스트 생리 적 조건 및 발달 단계에서 조직적 선구자의 시각화 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 프로토콜 Pax7/MF20 zebrafish 골격 근육12얼룩의 방법에 근거 했다. 사용 하 고 단계 차단 솔루션은 동일 하거나 유사한. 사용 하는 항 체는 동일 합니다. 조정된 단계 마우스 근육 조직과 SCs의 기능에 근거 했다. 첫째, 항 체 Laminin 시각화 하 고 SCs의 위치를 확인할 수 있도록 믹스에 추가 되었습니다. 그것은 특히 도움이 488/555;의 듀얼 필터 큐브를 사용 하 여 현미경 SCs의 수를 계?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 NIAMS 빛 이미징 섹션 현미경 및 기술 지원을 제공 합니다. MF20 및 Pax7 항 체 개발 연구 Hybridoma 은행은 NICHD의 후원 하에 개발 하 고 유지 관리 학과 생물 과학, 아이오의 대학, 아이오와 시티에서 얻은 했다. 이 작품은 국립 보건원의 NIAMS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
Referências
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