Irrigables réseau vasculaire avec un modèle de tissu dans un dispositif microfluidique
Summary
Le protocole décrit comment un réseau vasculaire irrigables dans un sphéroïde de l’ingénieur. Microenvironnement environnants de l’ellipsoïde est conçu pour induire l’angiogenèse et connecter l’ellipsoïde aux microcanaux dans un dispositif microfluidique. La méthode permet la perfusion de l’ellipsoïde, qui est une technique attendue dans les cultures en trois dimensions.
Abstract
Un sphéroïde (un agrégat multicellulaire) est considéré comme un bon modèle de tissus vivants dans le corps humain. Malgré l’avancement significatif dans les cultures de sphéroïde, un réseau vasculaire irrigables dans les sphéroïdes reste un défi crucial pour les cultures à long terme nécessaire pour maintenir et développer leurs fonctions, telles que les expressions de protéine et de morphogenèse. Le protocole présente une nouvelle méthode pour intégrer un réseau vasculaire irrigables dans l’ellipsoïde dans un dispositif microfluidique. Pour inciter un réseau vasculaire irrigables dans le sphéroïde, choux angiogénique connecté à microcanaux était guidés à l’ellipsoïde en utilisant des facteurs angiogéniques de fibroblastes pulmonaires humaines cultivées dans l’ellipsoïde. Les choux angiogénique atteint l’ellipsoïde, fusionnée avec les cellules endothéliales cultivées conjointement dans l’ellipsoïde et forment un réseau vasculaire continu. Le réseau vasculaire pourrait perfuse à l’intérieur de l’ellipsoïde sans aucune fuite. Le réseau vasculaire construit peut servir davantage comme une voie pour l’apport de nutriments et d’enlèvement des matières résiduelles, imitant de circulation de sang in vivo. La méthode fournit une nouvelle plate-forme dans la culture de sphéroïde vers mieux récapitulation des tissus vivants.
Introduction
Passer d’une culture (bidimensionnelle) monocouche à une culture en trois dimensions est motivée par la nécessité de travailler avec des modèles de culture qui imitent les fonctions cellulaires de la vie tissus1,2,3. Les substrats en plastique plats et durs couramment utilisés en culture cellulaire ne ressemblent pas à la plupart des environnements extracellulaires dans le corps humain. En effet, de nombreuses études démontrent cette architecture de tissu-spécifique de recréer en trois dimensions de la culture, des signaux mécaniques et biochimiques et communication de cellule-cellule, qui n’ont pas été observées dans la culture conventionnelle de deux dimensions4, 5,6,7,8.
Un agrégat multicellulaire ou ellipsoïde, est l’une des techniques plus prometteuses pour se rendre compte de cette culture en trois dimensions9,10. Les cellules sécrètent la matrice extracellulaire (ECM) et peuvent d’interagir avec d’autres de l’ellipsoïde. Bien que certains autre bioingénierie approches13,12,11,14, comme cellule d’empilage, répliquer avec succès la complexité spatiale du corps humain, ces approches ont seulement deux ou trois types de cellules pour la facilité d’analyse et concentré sur une seule fonction d’organes cibles. En revanche, les cellules en sphéroïdes sont exposées à des environnements de culture différente selon leurs positions dans l’ellipsoïde en raison de l’approvisionnement en nutriments, l’oxygène et paracrine et autocrine signalisation des molécules dans l’ellipsoïde hétérogène. Cette caractéristique des sphéroïdes reproduit partiellement en vivo condition de culture et d’activer les cellules en sphéroïdes à créer des tissus beaucoup plus complexe, organisé la structure in vitro que celles cultivées en empilement tissu9, 15 , 16. note que, si un sphéroïde est composé d’un seul type de cellules, la fonction des cellules de l’ellipsoïde n’est pas uniforme en raison de l’environnement hétérogène à l’ellipsoïde. En quelques années, cultures de sphéroïde autorisé des cellules souches embryonnaires (CSE), induite par les cellules souches pluripotentes (CISP) ou cellules souches de tissu-résident pour imiter les séquences de développement in vivo et recréer des mini-organes comme le cerveau17, du foie18et rein19,20.
Malgré des progrès importants dans les techniques de culture de sphéroïde, cultivant des sphéroïdes grands pendant une longue période est toujours problématique. Dans un tissu en trois dimensions, les cellules doivent être localisés au sein de 150 à 200 µm d’un vaisseau sanguin en raison de la quantité limitée d’oxygène et nutriments21. Les réseaux vasculaires au sein de l’ellipsoïde sont nécessaires pour récapituler les échanges de substances entre le sang et les tissus in vivo. Pour y parvenir, les autres groupes ont conjointement mis en culture des cellules endothéliales avec cible les cellules22,23,24 ou induit la différenciation des cellules pluripotentes dans CD31-positive cellules20. Néanmoins, les structures de navire comme signalés n’ont pas les extrémités ouvertes de la lumina pour fournir l’oxygène et des nutriments vers le centre de l’ellipsoïde. Pour simuler le rôle vasculaire pour nourrir les cellules dans la culture tridimensionnelle, ouvertes à tous et pleins de réseau vasculaire doit être développé dans l’ellipsoïde.
Au cours des dernières années, certains groupes de recherche dans le domaine de la microtechnique ont déclaré méthodes pour construire un réseau vasculaire irrigables, formé spontanément dans un dispositif microfluidique en utilisant des facteurs angiogéniques de fibroblastes cocultured25 ,26. Ces réseaux vasculaires ont une morphologie similaire à leurs homologues en vivo et peut être transformé par des facteurs environnementaux, ce qui les rend appropriés pour imiter les fonctions vasculaires dans une culture de sphéroïde. Ce protocole vise à construire un réseau vasculaire irrigables dans un sphéroïde utilisant une plate-forme de microfluidique27. Le dispositif microfluidique est modifié par l’ appareil a déjà été indiqué25 afin qu’un ellipsoïde peut être incorporé. En orientant la sécrétion angiogénique des cellules fibroblastes dans un sphéroïde aux cellules endothéliales de microcanaux, angiogénique choux des microcanaux anastomosées avec l’ellipsoïde et formée un réseau vasculaire irrigables. Cette méthode permet une livraison directe d’un large éventail de substances, telles que des molécules fluorescentes et perles l’échelle du micromètre à l’intérieur d’un sphéroïde, qui fournit le cadre pour une culture de tissus à long terme avec les réseaux vasculaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les rapports précédents montrent que BFVS sécrètent un cocktail de multiples facteurs angiogéniques angiopoietin-1, angiogenin, facteur de croissance des hépatocytes, transformant le facteur de nécrose tumorale et une matrice extracellulaire protéines29, facteur de croissance-α, 30. Cette analyse se fonde sur la sécrétion d’angiogénique de BFVS dans un sphéroïde de co-culture, qui est la limitation de la technique. Par conséquent, il est essenti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par CREST JST (numéro de licence JPMJCR14W4), société pour la Promotion of Science (JSPS) KAKENHI (numéro de licence 25600060, 16K 16386), le centre du programme d’Innovation de MEXT et JST, projet axé sur le développement clé évaluation technologique de Japan Agency for Medical Research and Development, AMED, Mizuho Fondation pour la Promotion des Sciences. Microfabrication était soutenue par Kyoto University Nano technologie Hub.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
Referências
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