미세 소자에서 조직 모델 perfusable 혈관 네트워크
Summary
프로토콜에는 회전 타원 체에 perfusable 혈관 네트워크를 설계 하는 방법을 설명 합니다. 회전 타원 체의 주변 microenvironment 신생 유도 microchannels 미세 장치에는 회전 타원 체 연결을 고안 이다. 메서드를 사용 하면 3 차원 문화에 오랫동안 기다려온 기술 회전 타원 체의 관류를 수 있습니다.
Abstract
회전 타원 체 (다세포 집계)는 인간의 신체에서 살아있는 조직의 좋은 모델으로 간주 됩니다. 회전 타원 체 문화에서 중요 한 발전에도 불구 하 고 perfusable 혈관 네트워크는 spheroids에 유지 하 고 단백질 식 및 morphogenesis 같은 그들의 기능을 개발 하는 데 필요한 장기 문화에 대 한 중요 한 도전 남아 있습니다. 프로토콜 미세 장치에서 회전 타원 체 내 perfusable 혈관 네트워크를 통합 하는 새로운 방법을 선물 한다. Perfusable 혈관 네트워크는 회전 타원 체에 유도, 신생 콩나물 microchannels에 연결 된 인간의 폐 섬유 아 세포는 회전 타원 체에 경작에서 신생 요소를 활용 하 여는 회전 타원 체를 유도 했다. 신생 콩나물 회전 타원 체, 회전 타원 체, 공동 경작 하는 내 피 세포와 합병을 도달 하 고 지속적인 혈관 네트워크를 형성 했다. 혈관 네트워크 어떤 유출 없이 회전 타원 체의 내부를 perfuse 수 있습니다. 생성 된 혈관 네트워크 영양분의 공급과 혈액 순환 비보를 흉내 낸 폐기물의 제거에 대 한 경로로 추가 사용 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 조직 생활의 더 나은 재현 부로 회전 타원 체 문화에서 새로운 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
생활의 세포질 기능을 모방 하는 문화 모델을 사용 하는 필요에 의해 자극 된다 3 차원 문화에 단층 (2 차원) 문화에서 변화 조직1,2,3. 일반적으로 세포 배양에 사용 하는 평평 하 고 단단한 플라스틱 기판 대부분을 인체에 extracellular 환경의 닮는 다 하지. 사실, 많은 연구가 보여주는 그 3 차원 문화 재현 조직 관련 건축, 기계 및 생 화 확 적인 신호 및 셀 통신, 기존의 2 차원 문화4에서에서 관찰 되었습니다 하지, 5,6,,78.
다세포 집계 또는 회전 타원 체,이 3 차원 문화9,10을 실현 하기 위해 가장 유망한 기술 중 하나입니다. 세포는 세포 외 기질 (ECM)을 분 비 하 고는 회전 타원 체에서 다른 사용자와 상호 작용할 수 있습니다. 비록 다른 바이오 접근11,12,,1314, 셀 스택 등 인체의 공간 복잡도 성공적으로 복제, 이러한 접근만 2 또는 3 분석의 용이성 및 대상 기관에 초점 을된 하나의 기능에 대 한 셀의 종류. 대조적으로, spheroids에 세포 영양분, 산소, paracrine autocrine 신호는 회전 타원 체에 분자의 다른 유형의 공급으로 인해 회전 타원 체에 그들의 위치에 따라 다른 문화 환경에 노출 됩니다. Spheroids의이 기능은 부분적으로 모방 문화 상태 vivo에서 그리고 생체 외에서 스태킹 조직9, 에서 교양 보다 훨씬 더 복잡 하 고, 조직 조직 만들 spheroids 셀 구조 사용 15 , 16.는 회전 타원 체는 세포의 단일 종류의 구성 되어, 경우는 회전 타원 체에 세포의 기능 하지 않습니다는 회전 타원 체에서 이기종 환경으로 인해 균일 한. 지난 몇 년 동안, 회전 타원 체 문화 허용 배아 줄기 세포 (ESCs), 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 또는 vivo에서 발달 순서를 모방 하 여 미니-17뇌 등 장기를 다시 조직 상주 줄기 세포 간18및 신장19,20.
회전 타원 체 문화 기술에 있는 뜻깊은 진도도 불구 하 고 오랜 동안 큰 spheroids 경작은 여전히 문제가 있다입니다. 3 차원 조직에서 세포를 150-200 µ m의 혈관 내 산소와 영양소21의 한정 된 공급 때문에 필요 합니다. 회전 타원 체 내 혈관 네트워크는 혈액과 조직 비보사이 교환 물질을 정리 하는 데 필요한. 이를 위해, 다른 그룹 공동 대상 셀22,,2324 과 내 피 세포를 배양 하거나 CD31-긍정적인 세포20로 만능 세포의 분화를 유도. 그럼에도 불구 하 고, 보고 된 선박-같은 구조는 회전 타원 체의 중심에 산소와 양분을 공급 하는 루미나의 열린 끝을 있지 않습니다. 3 차원 문화에 있는 세포 영양 혈관 역할을 모방 하는 회전 타원 체에 오픈 및 perfusable 혈관 네트워크를 개발 해야 합니다.
지난 몇 년 동안 microengineering 필드에 일부 연구 그룹 보고 cocultured fibroblast 세포25에서에서 신생 요소를 이용 하 여 미세 장치에 자발적으로 형성 된 perfusable 혈관 네트워크를 구성 하는 방법 ,26. 이러한 혈관 네트워크에 그들의 생체 내에서 유사한 형태학 있고 그들을 회전 타원 체 문화에 혈관 기능을 흉내 낸에 대 한 적당 한 만드는 환경 요인에 의해 개장 될 수 있다. 이 프로토콜의 목적은 미세 플랫폼27을 사용 하 여 회전 타원 체에 perfusable 혈관 네트워크를 구성 하는 것입니다. 미세 장치는 회전 타원 체 통합 될 수 있도록 이전에 보고 된 장치25 에서 수정 됩니다. Microchannels에서 내 피 세포에는 회전 타원 체에서 fibroblast 세포에서 신생 비 여, 신생은 회전 타원 체와 anastomosed microchannels에서 콩나물 하 고 perfusable 혈관 네트워크를 형성 했다. 이 메서드는 다양 한 형광 분자 및 혈관 네트워크와 장기 조직 문화에 대 한 프레임 워크를 제공 하는 회전 타원 체의 내부에 마이크로 미터 규모 구슬 같은 물질의 직접 배달 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전 보고서 보기 hLFs angiopoietin 1, angiogenin, hepatocyte 성장 인자, 성장 인자 α, 종양 괴 사 인자와 일부 세포 외 기질 단백질29, 변형 등의 여러 신생 요인의 칵테일을 분 비 30. 이 분석 결과에서 coculture 회전 타원 체, 기술의 한계는 hLFs에서 신생 비에 의존 합니다. 따라서, 그것은 coculture 회전 타원 체와 채널 1과 3에서에서 HUVECs 사이의 거리를 단축 될 수 있…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 크레스트 JST (보조금 번호 JPMJCR14W4), 사회 대는 승진의 과학 (JSP) KAKENHI (25600060, 16 K 16386 번호 부여), 문 부 과학성 및 JST, 프로젝트에서 키 평가 기술 개발에 초점을 맞춘 혁신 프로그램의 센터에 의해 지원 되었다 의료 연구 및 개발, 아메드, 미즈호 기초 과학의 승진을 위한 일본 기관. 소는 교토 대학교 나노 기술 허브에 의해 지원 되었다.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
Referências
- Abbott, A. Cell culture: Biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions – The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D., Yarmush, M. L. . Annual Review of Biomedical Engineering. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
