प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक अंडाकार आकृति में एक perfusable संवहनी नेटवर्क इंजीनियर है । है अंडाकार आकृति आसपास के microenvironment angiogenesis प्रेरित करने के लिए तैयार है और एक microchannels डिवाइस में microfluidic को अंडाकार आकृति कनेक्ट । विधि अंडाकार आकृति, जो तीन आयामी संस्कृतियों में एक लंबे समय से प्रतीक्षित तकनीक है की छिड़काव की अनुमति देता है ।
एक अंडाकार आकृति (एक कोशिकीय समग्र) मानव शरीर में ऊतकों के रहने का एक अच्छा मॉडल के रूप में माना जाता है । अंडाकार आकृति संस्कृतियों में महत्वपूर्ण उंनति के बावजूद, spheroids में एक perfusable संवहनी नेटवर्क दीर्घकालिक संस्कृति को बनाए रखने और उनके कार्यों, जैसे प्रोटीन अभिव्यक्ति और morphogenesis के विकास के लिए आवश्यक के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है । प्रोटोकॉल एक microfluidic डिवाइस में अंडाकार आकृति के भीतर एक perfusable संवहनी नेटवर्क को एकीकृत करने के लिए एक उपंयास विधि प्रस्तुत करता है । अंडाकार आकृति में एक perfusable संवहनी नेटवर्क पैदा करने के लिए, angiogenic microchannels से जुड़े अंकुरित अंडाकार आकृति में मानव फेफड़े angiogenic से fibroblasts कारकों का उपयोग करके अंडाकार आकृति के लिए निर्देशित किया गया । angiogenic अंकुरित अंडाकार आकृति तक पहुंच, endothelial अंडाकार आकृति में सह संस्कृति के साथ विलय, और एक सतत संवहनी नेटवर्क का गठन किया । संवहनी नेटवर्क किसी भी रिसाव के बिना अंडाकार आकृति के इंटीरियर perfuse सकता है । निर्माण संवहनी नेटवर्क आगे पोषक तत्वों की आपूर्ति और अपशिष्ट उत्पादों को हटाने के लिए एक मार्ग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, vivo मेंरक्त परिसंचरण नकल उतार । विधि अंडाकार आकृति संस्कृति में रहने वाले ऊतकों के बेहतर recapitulation की ओर एक नया मंच प्रदान करता है ।
एक monolayer से (दो आयामी संस्कृति) एक तीन आयामी संस्कृति से स्थानांतरण के लिए संस्कृति मॉडल है कि रहने वाले ऊतकों1,2,3के सेलुलर कार्य नकल के साथ काम करने की आवश्यकता से प्रेरित है । आमतौर पर सेल संस्कृति में प्रयुक्त फ्लैट और हार्ड प्लास्टिक सब्सट्रेट मानव शरीर में extracellular वातावरण के सबसे समान नहीं है । वास्तव में, कई अध्ययनों से यह है कि तीन आयामी संस्कृति ऊतक विशिष्ट वास्तुकला, यांत्रिक और जैव रासायनिक cues, और सेल-सेल संचार है, जो पारंपरिक दो आयामी संस्कृति4में नहीं देखा गया है बहलाना का प्रदर्शन है, 5,6,7,8.
एक कोशिकीय सकल या अंडाकार आकृति, सबसे होनहार तकनीकों में से एक है इस तीन आयामी संस्कृति का एहसास 9, 10 । कोशिकाओं extracellular मैट्रिक्स (ECM) स्राव और अंडाकार आकृति में दूसरों के साथ बातचीत कर सकते हैं. हालांकि कुछ अंय इंजीनियरिंग11के दृष्टिकोण,12,13,14, जैसे सेल स्टैकिंग, सफलतापूर्वक मानव शरीर के स्थानिक जटिलता को दोहराने, इन दृष्टिकोण केवल दो या तीन है विश्लेषण की आसानी के लिए कोशिकाओं के प्रकार और लक्ष्य अंगों के केवल एक समारोह पर ध्यान केंद्रित । इसके विपरीत, spheroids में कोशिकाओं को विभिंन संस्कृति पोषक तत्वों, ऑक्सीजन की विषम आपूर्ति के कारण अंडाकार आकृति में उनकी स्थिति के आधार पर वातावरण को उजागर कर रहे हैं, और paracrine और अंडाकार आकृति में autocrine संकेत अणुओं । spheroids की यह सुविधा आंशिक रूप से vivo संस्कृति हालत में नकल और कोशिकाओं को सक्षम करने के लिए और अधिक जटिल बनाने के लिए spheroids में, संगठित ऊतक संरचना के इन विट्रो में से उन कल्चरल स्टैकिंग ऊतक9, 15 , 16. ध्यान दें कि यदि किसी अंडाकार आकृति में एक ही प्रकार की कोशिकाएं शामिल होती हैं, तो अंडाकार आकृति में प्रकोष्ठों का कार्य अंडाकार आकृति में विषम वातावरण के कारण एकरूप नहीं होता है. पिछले कुछ वर्षों में, अंडाकार आकृति संस्कृतियों भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की अनुमति दी (ESCs), प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) या ऊतक-निवासी स्टेम कोशिकाओं vivo विकासात्मक दृश्यों में नकल करने के लिए और इस तरह के मस्तिष्क 17 के रूप में मिनी अंगों बहलाना, लिवर18और किडनी19,20.
अंडाकार आकृति संस्कृति तकनीक में उल्लेखनीय प्रगति के बावजूद, संवर्धन बड़े spheroids एक लंबे समय के लिए अभी भी समस्याग्रस्त है । एक तीन आयामी ऊतक में, कोशिकाओं क्योंकि ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की सीमित आपूर्ति के21के एक रक्त वाहिका के 150-200 µm के भीतर स्थित होने की जरूरत है । अंडाकार आकृति के भीतर संवहनी नेटवर्क vivoमें रक्त और ऊतकों के बीच पदार्थों का आदान प्रदान दोहराऊंगा करने के लिए आवश्यक हैं । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, अंय समूहों के22,23,24 या CD31-धनात्मक कोशिकाओं20में pluripotent कोशिकाओं के भेदभाव प्रेरित endothelial कोशिकाओं के साथ सह-कल्चर्ड है । फिर भी, रिपोर्ट पोत तरह संरचनाओं lumina के खुले सिरों को ऑक्सीजन और अंडाकार आकृति के केंद्र के लिए पोषक तत्वों की आपूर्ति नहीं है । संवहनी भूमिका की नकल करने के लिए तीन आयामी संस्कृति में कोशिकाओं को पोषण, खुले समाप्त और perfusable संवहनी नेटवर्क अंडाकार आकृति में विकसित किया जाना चाहिए ।
पिछले कुछ वर्षों के दौरान, कुछ अनुसंधान समूहों microengineering क्षेत्र में एक perfusable संवहनी नेटवर्क का निर्माण करने के लिए तरीकों की सूचना दी, अनायास cocultured fibroblast कोशिकाओं 25 से angiogenic कारकों का उपयोग करके एक microfluidic डिवाइस में गठन ,26. इन संवहनी नेटवर्क vivo समकक्षों में उनके लिए एक समान आकृति विज्ञान है और उन्हें एक अंडाकार आकृति संस्कृति में संवहनी कार्यों नकल उतार के लिए उपयुक्त बनाने, पर्यावरणीय कारकों द्वारा remodeled किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक अंडाकार आकृति में एक perfusable संवहनी नेटवर्क का निर्माण एक microfluidic मंच 27 का उपयोग कर रहा है । microfluidic डिवाइस को पहले से रिपोर्ट किए गए डिवाइस25 से संशोधित किया जाता है ताकि कोई अंडाकार आकृति शामिल हो सके । microchannels में endothelial कोशिकाओं को एक अंडाकार आकृति में fibroblast कोशिकाओं से angiogenic स्राव को निर्देशित करके angiogenic microchannels के साथ anastomosed अंकुरित अंडाकार आकृति और एक perfusable संवहनी नेटवर्क का गठन किया । इस विधि एक अंडाकार आकृति है, जो संवहनी नेटवर्क के साथ एक दीर्घकालिक ऊतक संस्कृति के लिए रूपरेखा प्रदान करता है के इंटीरियर में फ्लोरोसेंट अणुओं और माइक्रोमीटर पैमाने पर मोतियों के रूप में पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला, की एक सीधी डिलीवरी की अनुमति देता है ।
पिछले रिपोर्टों से पता चलता है कि hLFs इस तरह के angiopoietin-1, angiogenin, hepatocyte वृद्धि कारक के रूप में कई angiogenic कारकों, के एक कॉकटेल स्रावित, विकास कारक बदलने-α, ट्यूमर परिगलन कारक और कुछ extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन29, </su…
The authors have nothing to disclose.
यह काम शिखा JST (ग्रांट नंबर JPMJCR14W4), सोसायटी ऑफ साइंस (JSPS) KAKENHI (ग्रांट नंबर २५६०००६०, 16K16386), MEXT और JST से नवाचार कार्यक्रम के केंद्र, परियोजना से प्रमुख मूल्यांकन प्रौद्योगिकी के विकास पर केंद्रित द्वारा समर्थित था जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एण्ड डेवलपमेंट, एमएड, मिजुहो फाउंडेशन फॉर प्रमोशन ऑफ साइंसेज । Microfabrication को क्योटो यूनिवर्सिटी नैनो टेक्नोलॉजी हब का सपोर्ट मिला ।
AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
Aceton | Wako | 012-00343 | |
Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
2-propanol | Wako | 163-04841 | |
Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
Collagen I | Corning | 354236 | |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |