Belysning op veje til Caspase aktivering ved hjælp af Bimolecular fluorescens komplementering
Summary
Denne protokol beskriver caspase Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC); en billeddannelse-baserede metode, der kan bruges til at visualisere induceret nærhed af initiatoren caspases, som er det første skridt i deres aktivering.
Abstract
Familien caspase af proteaser spiller en afgørende rolle i apoptose og medfødt immunitet. Blandt disse er en undergruppe, kendt som initiativtager caspases først til at blive aktiveret i disse veje. Denne gruppe omfatter caspase-2, -8, samt -9 og den inflammatoriske caspases, caspase-1, -4 og -5. Initiatoren caspases aktiveres alle ved dimerization efter rekruttering til specifikke multiprotein komplekser kaldes aktivering platforme. Caspase Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) er en billedbehandling-baseret tilgang, hvor split fluorescerende proteiner smeltet til initiativtager caspases bruges til at visualisere ansættelse af initiatoren caspases til deres aktivering platforme og den deraf følgende induceret nærhed. Denne fluorescens giver en udlæsning af en af de tidligste trin, der kræves for initiatoren caspase aktivering. Ved hjælp af en række forskellige mikroskopi-baserede tilgange, kan denne teknik give kvantitative data om effektiviteten af caspase aktivering på befolkningsniveau samt kinetik af caspase aktivering og størrelsen på og antallet af caspase aktivering komplekser på pr. celle basis.
Introduction
Familien caspase protease er kendt for deres kritiske roller i apoptose og medfødt immunitet 1. På grund af deres betydning, bestemme Hvornår, hvor, og hvor effektivt specifikke caspases er aktiveret kan give afgørende indsigt i mekanismerne af caspase aktivering veje. Imaging baseret protokollen beskrevet her giver mulighed for visualisering af de tidligste trin i caspase aktivering cascade. Denne teknik tager fordel af de dynamiske protein: protein interaktioner at drive caspase aktivering.
Caspases kan opdeles i to grupper: initiativtager caspases (caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 og -12) og bøddel caspases (caspase-3, -6 og -7). Bøddel caspases er til stede i cellen som præfabrikerede dimere og aktiveres ved spaltning mellem store og små subunit 2. Når aktiveret, kløver de talrige strukturelle og regulerende proteiner resulterer i apoptose 3. Initiator-caspases er den første caspases at blive aktiveret i en pathway og aktivering af bøddel caspases vil normalt udløse. I modsætning til bøddel caspases aktiveres initiativtager caspases ved dimerization 4,5. Denne dimerization lettes ved ansættelse af inaktive monomerer til specifikke store molekylvægt komplekser kendt som aktivisering platforme. Montering af aktivering platforme er underlagt en række specifikke protein: protein interaktioner. Disse er medieret af bevarede protein interaktion motiver i den proform af initiatoren caspase og omfatter død domæne (DD), død effektor domæne (DED) og caspase rekruttering domæne (kort) 6 (figur 1A). Aktivering platforme generelt omfatter en receptor protein og en adapter protein. Receptoren er normalt aktiveret ved binding af en ligand, inducerende en konformationel ændring, der giver mulighed for oligomerisering af talrige molekyler. Receptoren derefter rekrutter enten caspase direkte eller adapter molekyler, der igen bringer caspase til komplekset. Således kommer talrige caspase molekyler i umiddelbar nærhed af tillader dimerization. Dette er kendt som den inducerede nærhed model 7. Når dimerized, gennemgår caspase følgende, som tjener til at stabilisere den aktive enzym 4,8. For eksempel, er montering af Apaf1 apoptosome udløst af cytokrom c efter sin løsladelse fra mitokondrier i en proces kaldet ydre membran permeabilization (Lungebetændelse). Apaf1 rekrutter igen caspase-9 gennem en interaktion, der er medieret af et kort til stede i begge proteiner 9. Lignende protein interaktioner resultatet i forsamlingen af CD95 død inducerende signalering komplekse (DISC) der fører til aktivering af caspase-8; PIDDosome, som kan aktivere caspase-2; og forskellige inflammasome komplekser, der indlede caspase-1 aktivering 10,11,12. Således rekrutteres initiativtager caspases til specifikke aktivering platforme af en fælles ordning resulterer i induceret nærhed og dimerization, uden hvilken aktivering vil ikke forekomme.
Caspase Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) er en billedbehandling-baseret analyse, der blev udviklet for at måle dette første trin i aktivering af initiatoren caspases, giver mulighed for direkte visualisering af caspase induceret nærhed efter aktivering platform forsamling. Denne metode udnytter af split fluorescerende proteiner Venus egenskaber. Venus er en lysere og mere photostable version af gul fluorescerende proteiner (YFP), der kan opdeles i to ikke-fluorescerende og lidt overlappende fragmenter: N-terminus Venus (Venus N eller VN) og C-terminus Venus (Venus C eller VC). Disse fragmenter bevarer evnen til at refold og bliver fluorescerende når i umiddelbar nærhed af 13. Hver Venus fragment er sammenvokset til prodomain af caspase, som er en minimal del af caspase, der binder sig til aktivisering platform. Dette sikrer, at caspases beholder ikke indstillingen enzymatisk aktivitet og derfor samtidige analyse af downstream hændelser i forbindelse med endogene arrangementer er muligt. Venus fragmenter refold når caspase prodomains rekrutteres til aktivering platform og gennemgå induceret nærhed. (Figur 1B). Den resulterende Venus fluorescens kan bruges til at nøjagtigt og konkret overvåge subcellulært lokalisering, at kinetik og effektiviteten af forsamling af initiatoren caspase aktivering platforme i enkelte celler. Imaging data kan erhverves ved Konfokal mikroskopi eller standard Fluorescens mikroskopi og kan tilpasses til en række forskellige mikroskopi metoder herunder: time-lapse imaging for at spore caspase aktivering i realtid; høj opløsning imaging til præcis bestemmelse af subcellulært lokalisering; og slutpunktet kvantificering af effektiviteten af aktivering.
Denne teknik blev først udviklet for at undersøge aktivering af caspase-214. Mens aktivisering platformen for caspase-2 menes at være PIDDosome, bestående af receptor PIDD (p53-induceret protein med en død domæne) og adapter RAIDD (RIP-associerede ICH-1/CAD-3 homologe protein med en død domæne), PIDDosome-uafhængig caspase-2 aktivering er blevet rapporteret. Dette tyder på, at yderligere aktivering platforme for caspase-2 findes 15,16. På trods af ikke at vide de fulde komponenter af caspase-2 aktivering platform, har caspase BiFC teknik tilladt for vellykket forhør af caspase-2 signalering veje på det molekylære niveau 14,17. Vi har også med succes tilpasset denne protokol for den inflammatoriske caspases (caspase-1, -4, -5 og -12) 18 og i princippet den samme tilgang bør være tilstrækkelige til ligeledes analysere hver af de resterende initiativtager caspases. Denne protokol kunne ligeledes være tilpasset til at undersøge andre veje var dimerization er en stor aktiverende signal. For eksempel, er STAT proteiner aktiveret af dimerization efter fosforylering af Janus kinase (JAK) 19. Således kan BiFC system anvendes til at visualisere for STAT aktivering samt mange andre veje, reguleret af dynamiske protein interaktioner. Følgende protokol giver trinvise instruktioner for indførelsen af journalister i celler samt metoder til billede erhvervelse og analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver brugen af split fluorescerende proteiner til at måle caspase induceret nærhed. Split Venus blev valgt for denne teknik, fordi det er meget lyse, højt photostable og den hvorved man genfolder er hurtig 13. Således, analysen af Venus, hvorved man genfolder ved caspase induceret nærhed kan give tæt på realtid skøn caspase protein interaktion dynamikker. Venus er opdelt i to lidt overlappende fragmenter, Venus (Venus-N eller VN) bestående af aminosyrer 1-173 N endesta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende alle de tidligere medlemmer af Bouchier-Hayes lab, der har bidraget til udviklingen af denne teknik. Dette arbejde var delvis finansieret af en Texas children’s Hospital Pediatric Pilot award til LBH. Vi takker Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) om tilladelse til at omfatte data udgives i samarbejde med hendes team. Udviklingen af reagenserne beskrevet blev støttet af flowcytometri og celle sortering Core på Baylor College of Medicine med midler fra NIH (NIAID P30AI036211, NIC P30CA125123 og NCRR S10RR024574) og bistand fra Joel M. Sederstrom
Materials
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don’t know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
