تضيء سبل تفعيل Caspase استخدام التكامل Bimolecular Fluorescence
Summary
ويصف هذا البروتوكول caspase Bimolecular Fluorescence التكامل (بيفك)؛ أسلوب المستندة إلى التصوير التي يمكن استخدامها لتصور قرب المستحث للبادئ caspases، وهو الخطوة الأولى في تفعيل تلك.
Abstract
الأسرة caspase من البروتياز أدواراً أساسية في المبرمج والحصانة الفطرية. ومن بين هذه هي فرعي المعروفة باسم caspases البادئ الأولى لتفعيلها في هذه المسارات. وتشمل هذه المجموعة caspase-2،-8، و-9، فضلا عن caspases التحريضية، كاسباسي-1،-4، و-5. يتم تنشيط جميع caspases البادئ من ثنائي بعد التعيين إلى مجمعات مولتيبروتين محددة يسمى منصات التنشيط. Caspase Bimolecular Fluorescence التكامل (بيفك) هو نهج القائم على التصوير فيها تقسيم البروتينات الفلورية تنصهر للبادئ وتستخدم كاسباسيس لتصور توظيف caspases البادئ لبرامجهم التنشيط وما يترتب على ذلك قرب المستحث. وتوفر هذه الأسفار قراءات لواحدة من أولى الخطوات المطلوبة لتفعيل caspase البادئ. باستخدام عدد من مختلف النهج القائم على الفحص المجهري، هذا الأسلوب يمكن أن توفر البيانات الكمية على كفاءة تفعيل caspase على مستوى سكان، فضلا عن حركية تفعيل caspase وحجم وعدد من تفعيل caspase المجمعات على أساس كل خلية.
Introduction
الأسرة حوزتي caspase معروفة بأدوارها الحاسمة في المبرمج والحصانة الفطرية 1. نظراً لما لها من الأهمية تحديد متى، أين، ومدى كفاءة يتم تنشيط caspases محددة يمكن أن توفر رؤى حاسمة في آليات caspase مسارات التنشيط. البروتوكول على أساس التصوير الموصوفة هنا يمكن تصور الخطوات الأولى في تتالي التنشيط كاسباسي. ويستفيد هذا الأسلوب التفاعلات الدينامية البروتين: البروتين أن تفعيل caspase محرك الأقراص.
Caspases يمكن تقسيمها إلى مجموعتين: caspases البادئ (caspase-1،-2،-4،-5،-8،-9،-10 و-12) و caspases الجلاد (caspase-3،-6، و-7). موجودة في الخلية ك dimers بريفورميد caspases الجلاد ويتم تنشيطها بالانقسام بين وحدة فرعية كبيرة وصغيرة 2. عند تنشيط، أنها تنشق العديد من البروتينات الهيكلية والتنظيمية أدى إلى المبرمج 3. Caspases البادئ هي كاسباسيس الأولى تفعيلها في طريق، وعموما يؤدي تنشيط caspases الجلاد. وعلى النقيض من الجلاد caspases، يتم تنشيط caspases البادئ من ثنائي 4،5. هذا ثنائي يسهل تجنيد مونومرات الخاملة إلى مجمعات محددة الوزن الجزيئي الكبير المعروف بتفعيل الأنظمة الأساسية. الجمعية العامة لتنشيط منصات محكوم بسلسلة من التفاعلات المحددة البروتين: البروتين. هذه هي وساطة من البروتين المصانة التفاعل زخارف موجودة في بروفورم من caspase البادئ وتشمل المجال الموت (دد) والموت المستجيب المجال (الدائرة) و caspase تعيين المجال (بطاقة) 6 (الشكل 1A). عموما تشمل منصات تنشيط مستقبلات بروتين وبروتين محول. عادة ما يتم تنشيط المستقبلات عليه ملزم ليجند، حفز تغيير كونفورماشونال الذي يسمح أوليجوميريزيشن جزيئات عديدة. ثم المجندين المستقبلات أما caspase مباشرة أو محول الجزيئات التي تجلب بدورها في كاسباسي إلى المجمع. وهكذا، تأتي العديد من الجزيئات caspase إلى مقربة من السماح لثنائي. هذا هو المعروف بنموذج قرب المستحث 7. بمجرد ديميريزيد، يخضع كاسباسي حدث، مما يؤدي إلى استقرار في نشاط إنزيم 4،8. على سبيل المثال، يتم تشغيل جمعية أبوبتوسومي Apaf1 بواسطة ج الفسفرة عقب الإفراج عنها من الميتوكوندريا في عملية تسمى الميتوكوندريا الغشاء الخارجي permeabilization (الموقع). Apaf1 المجندين بدوره caspase-9 عن طريق تفاعل الذي هو توسط بطاقة موجودة في كلا البروتينات 9. نتيجة تفاعلات البروتين مماثلة في الجمعية CD95 وفاة حمل إشارات معقدة (القرص) الذي يؤدي إلى تفعيل caspase-8؛ بيدوسومي، التي يمكن تفعيل caspase-2؛ ومختلف مجمعات إينفلاماسومي أن الشروع في تفعيل caspase-1 10،،من1112. وهكذا، يجند caspases البادئ إلى منصات التنشيط محددة بإنشاء إليه مشتركة مما أدى إلى قرب المستحث وثنائي، التي بدونها لن يحدث التنشيط.
Caspase Bimolecular Fluorescence التكامل (بيفك) هو تحليل القائم على التصوير التي وضعت لقياس هذه الخطوة الأولى في تفعيل caspases البادئ، والسماح للتصور مباشرة قرب كاسباسي التي يسببها اتباع منهاج التنشيط الجمعية. يأخذ هذا الأسلوب تستفيد خصائص البروتين انقسام نيون فينوس. كوكب الزهرة هو أكثر إشراقا وأكثر فوتوستابل نسخة من البروتين نيون أصفر (يفب) التي يمكن فصلها في الأجزاء غير الفلورية وتداخل طفيف اثنين: N-المحطة الزهرة (فينوس N أو VN) وج-المحطة فينوس (الزهرة ج أو الرأسمالي). هذه الشظايا الاحتفاظ بالقدرة على ريفولد وتصبح الفلورسنت عند في مقربة من 13. هو تنصهر فيها كل جزء الزهرة إلى برودومين من كاسباسي، وهو الجزء الأدنى من كاسباسي الذي يربط إلى منصة التنشيط. وهذا ما يضمن أن لا تحتفظ caspases النشاط الأنزيمي وذلك التحليل المتزامن لإحداث المتلقين للمعلومات المرتبطة بالأحداث الذاتية من الممكن. وشظايا فينوس ريفولد عند برودومينس caspase يعينون لمنصة التنشيط والخضوع لقربها المستحث. (الشكل 1B). الأسفار فينوس الناتجة يمكن أن ترصد بدقة وعلى وجه التحديد التعريب سوبسيلولار وحركية كفاءة جمعية منصات تفعيل caspase البادئ في الخلايا المفردة. تصوير البيانات يمكن الحصول عليها بالفحص المجهري [كنفوكل] أو بواسطة الفحص المجهري fluorescence القياسية ويمكن تكييفها مع عدد من النهج مجهرية مختلفة بما في ذلك: الوقت الفاصل بين التصوير لتتبع تفعيل caspase في الوقت الحقيقي؛ التصوير عالية الدقة لتحديدات دقيقة للتعريب سوبسيلولار؛ ونقطة النهاية الكمي للكفاءة للتنشيط.
ووضع هذا الأسلوب أولاً للتحقيق في تفعيل caspase-214. بينما برنامج تفعيل caspase-2 يعتقد أن بيدوسومي، تتألف من مستقبلات بيد (بروتين p53 المستحثة مع مجال موت) ومحول ريد (المرتبطة بالتمزق معنوي-1/CAD-3 بروتين مثلى مع مجال موت)، وأبلغ تفعيل caspase-2 بيدوسومي–المستقلة. وهذا يوحي بوجود مناهج إضافية تفعيل caspase-2 15،16. على الرغم من عدم معرفة كامل مكونات النظام الأساسي تفعيل caspase-2، سمح caspase بيفك تقنية للاستجواب ناجحة من مسارات الإشارات caspase-2 في المستوى الجزيئي 14،17. لقد تكيفت أيضا بنجاح هذا البروتوكول بالنسبة caspases التحريضية (caspase-1،-4،-5 و-12) 18 ، وعلى نفس النهج من حيث المبدأ، ينبغي أن تكون كافية لتحليل كل من caspases البادئ المتبقية وبالمثل. هذا البروتوكول يمكن تكييفها على نحو مماثل للتحقيق في مسارات أخرى كانت ثنائي إشارة تفعيل رئيسية. على سبيل المثال، يتم تنشيط البروتينات ستات من ثنائي بعد الفسفرة يانوس كيناز (جاك) 19. وهكذا، يمكن استخدام نظام بيفك وضع تصور لتفعيل القانون الأساسي، فضلا عن العديد من مسارات أخرى تخضع لتفاعلات البروتين الحيوي. ويوفر البروتوكول التالية إرشادات خطوة بخطوة للأخذ بالصحفيين في الخلايا وكذلك منهجيات للحصول على الصور، وتحليل.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويناقش هذا البروتوكول استخدام تقسيم البروتينات الفلورية لقياس caspase الناجمين عن قرب. واختير “فينوس تقسيم” لهذه التقنية لأنها مشرقة جداً، عالية فوتوستابل وريفولدينج هو سرعة 13. وهكذا، يمكن أن توفر تحليل فينوس ريفولدينج عند caspase الناجمين عن قرب قريبة من تقديرات caspase البروتين دينا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نعترف بجميع الأعضاء السابقة المختبر بوشير-هايز الذين ساهموا في تطوير هذه التقنية. تم تمويل هذا العمل جزئيا بجائزة الطيار طب الأطفال مستشفى تكساس للأطفال إلى LBH. ونحن نشكر شاندرا جويا (MD أندرسون، هيوستن، تكساس) للحصول على إذن تشمل البيانات التي نشرت بالتعاون مع فريق لها. تطوير الكواشف ووصف أيده الخلوي والخلية الأساسية الفرز في “كلية بايلور للطب” بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (نييد P30AI036211، NCI P30CA125123، ونكرر S10RR024574) ومساعدة جويل م. سيديرستروم
Materials
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don’t know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
