Summary
Dieses Protokoll beschreibt Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC); eine Imaging-basierte Methode, die verwendet werden, um induzierte Nähe der Initiator Caspasen, zu visualisieren, das ist der erste Schritt in ihre Aktivierung.
Abstract
Die Familie Caspase Proteasen spielen eine entscheidende Rolle in Apoptose und angeborene Immunität. Unter diesen eine Untergruppe, bekannt als Initiator Caspasen sind die ersten, die in diesen Bahnen aktiviert werden. Zu dieser Gruppe gehören Caspase-2-9-8, sowie die inflammatorischen Caspasen, Caspase-1,-4 und-5. Der Initiator Caspasen sind alle durch Dimerisierung nach der Einstellung zu bestimmten Multi-komplexe genannt Aktivierung Plattformen aktiviert. Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC) ist ein Imaging-basierte Ansatz dem geteilt fluoreszierende Proteine fusioniert, Initiator Caspasen verwendet, um die Rekrutierung von Initiator Caspasen zu ihrer Aktivierung-Plattformen und die daraus resultierenden visualisieren induzierte Nähe. Diese Fluoreszenz bietet eine Anzeige von einer der frühesten für Initiator Caspase Aktivierung erforderlichen Schritte. Mit einer Reihe von verschiedenen Mikroskopie-basierte Ansätze, bieten diese Technik quantitative Daten über die Effizienz der Caspase-Aktivierung auf einem Niveau der Bevölkerung sowie die Kinetik der Caspase-Aktivierung und die Größe und Anzahl der Aktivierung von caspase komplexe pro Zelle.
Introduction
Die Caspase-Protease-Familie sind bekannt für ihre kritischen Rollen in Apoptose und angeborene Immunität 1. Wegen ihrer Bedeutung bestimmen, wann, wo und wie effizient bestimmte Caspasen aktiviert bieten entscheidende Einblicke in die Mechanismen der Caspase Aktivierung Wege. Die Bildgebung basierende Protokoll hier beschriebenen ermöglicht die Visualisierung der ersten Schritte in der Caspase-Kaskade Aktivierung. Diese Technik nutzt die dynamische Protein: Protein-Interaktionen, dass Laufwerk Caspase-Aktivierung.
Die Caspasen können in zwei Gruppen unterteilt werden: der Initiator Caspasen (Caspase-1, -2,-4-5, -8,-9,-10 und-12) und der Henker Caspasen (Caspase-3,-6 und-7). Der Henker Caspasen befinden sich in der Zelle als vorgeformte Dimere und werden durch Spaltung zwischen den großen und kleinen Untereinheit 2aktiviert. Wenn aktiviert, Spalten sie zahlreiche strukturelle und regulatorische Proteine wiederum Apoptose 3. Der Initiator Caspasen sind die ersten Caspasen in einen Pfad aktiviert werden und in der Regel die Aktivierung der Henker Caspasen auslösen. Im Gegensatz zum Henker Caspasen werden durch Dimerisierung 4,5Initiator Caspasen aktiviert. Diese Dimerisierung wird durch Rekrutierung von inaktiven Monomeren zu bestimmten hohem Molekulargewicht komplexe bekannt als Aktivierung Plattformen erleichtert. Montage der Aktivierung Plattformen unterliegt einer Reihe von spezifischen Protein: Protein-Interaktionen. Diese sind vermittelt durch konserviertes Protein Interaktion Motive in der proform Initiator Caspase vorhanden und gehören der Tod Domäne (DD), Tod-Effektor-Domäne (DED) und Caspase Recruitment Domain (CARD) 6 (Abb. 1A). Aktivierung-Plattformen umfassen in der Regel einen Rezeptor und eine Adapter-Protein. Der Rezeptor wird in der Regel bei der Bindung eines Liganden induziert eine Konformationsänderung, die die Oligomerisierung von zahlreichen Molekülen ermöglicht aktiviert. Der Rezeptor rekrutiert dann entweder die Caspase direkt oder Adapter-Moleküle, die wiederum die Caspase in die Anlage bringen. So kommen zahlreiche Caspase-Moleküle in der Nähe schönem Dimerisierung. Dies wird als induzierte Nähe Modell 7bezeichnet. Sobald dimerized, erfährt die Caspase Autoprocessing, die dazu dient, das aktive Enzym 4,8zu stabilisieren. Montage von Apaf1 Apoptosome wird z. B. durch Cytochrom c nach seiner Entlassung aus den Mitochondrien in einem Prozess namens mitochondrialen Außenmembran Permeabilisierung (MOMP) ausgelöst. Apaf1 Rekruten wiederum Caspase-9 durch eine Interaktion, die durch eine Karte in beiden Proteine 9vermittelt wird. Ähnlich wie Protein-Interaktionen führen in der Montage von CD95 Tod induzieren, komplexen Signalisierung (DISC), der zur Aktivierung der Caspase-8 führt; die PIDDosome, die Caspase-2 aktivieren können; und verschiedenen Inflammasome-komplexe, die Aktivierung der Caspase-1 10,11,12zu initiieren. So, sind Initiator Caspasen, spezifische Aktivierung Plattformen rekrutiert, durch einen gemeinsamen Mechanismus, wodurch induzierte Nähe und Dimerisierung, ohne die Aktivierung nicht erfolgt.
Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC) ist ein Imaging-basierte Test, der entwickelt wurde, um diesen ersten Schritt bei der Aktivierung von Initiator Caspasen Messen ermöglicht direkten Visualisierung der Caspase induzierte Nähe nach Aktivierung Plattform Montage. Diese Methode nutzt die Eigenschaften des geteilten fluoreszierenden Proteins Venus. Venus ist ein heller und mehr photostabilen Version gelb fluoreszierenden Proteins (YFP), die in zwei nicht-fluoreszierende und leicht überlappende Fragmente unterteilt werden kann: der N-Terminus von Venus (Venus N oder VN) und dem C-Terminus der Venus (Venus C oder VC). Diese Fragmente behalten die Fähigkeit zu entfalten und fluoreszierende wenn in unmittelbarer Nähe 13. Jedes Fragment Venus ist mit der prodomain der Caspase ist an der Aktivierung Plattform bindet den minimalen Teil der Caspase verschmolzen. Dadurch behalten die Caspasen nicht enzymatische Aktivität und daher ist die gleichzeitige Analyse der nachgeschalteten Ereignisse im Zusammenhang mit endogenen Veranstaltungen möglich. Die Venus Fragmente Zurückfaltung, wenn die Caspase-Prodomains zur Aktivierung Plattform rekrutiert und induzierte Nähe zu unterziehen. (Abbildung 1 b). Die daraus resultierende Venus Fluoreszenz lässt sich präzise und speziell die subzelluläre Lokalisation, die Kinetik und die Effizienz der Versammlung der Initiator Caspase Aktivierung Plattformen in einzelnen Zellen überwachen. Bilddaten können erworben werden, durch konfokale Mikroskopie oder standard Fluoreszenz-Mikroskopie und kann auf eine Reihe von verschiedenen Mikroskopie Ansätzen einschließlich angepasst werden: Zeitraffer imaging zu verfolgen Caspase-Aktivierung in Echtzeit; hochauflösende Bildgebung für die präzise Bestimmung der subzellulären Lokalisierung; und Endpunkt Quantifizierung der Effizienz der Aktivierung.
Diese Technik wurde zuerst entwickelt, um die Aktivierung von Caspase-214zu untersuchen. Während die Aktivierung Plattform für Caspase-2 angenommen wird, die PIDDosome, bestehend aus den Rezeptor PIDD (p53-induzierte Protein mit einer Domäne Tod) und der Adapter RAIDD (RIP-assoziierte ICH-1/CAD-3 homologen Protein mit einer Domäne Tod), PIDDosome-unabhängige Caspase-2 Aktivierung wurde berichtet. Dies deutet darauf hin, dass zusätzliche Aktivierung Plattformen für Caspase-2 15,16vorhanden. Trotz nicht zu wissen, die volle Komponenten der Aktivierung der Caspase-2-Plattform, hat die Caspase BiFC Technik für erfolgreiche Befragung der Caspase-2 Signalwege auf der molekularen Ebene 14,17erlaubt. Wir haben dieses Protokoll für die inflammatorischen Caspasen (Caspase-1,-4 und-5-12) auch erfolgreich angepasst 18 und im Prinzip der gleiche Ansatz sollte ausreichen, ebenso jede der verbleibenden Initiator Caspasen zu analysieren. Dieses Protokoll kann entsprechend angepasst werden, andere Wege zu untersuchen wurden Dimerisierung ist eine wichtige aktivierende Zeichen. STAT-Proteine werden zum Beispiel durch Dimerisierung nach Phosphorylierung von Janus Kinase (JAK) 19aktiviert. So konnte das BiFC System einsetzbar für STAT Aktivierung sowie viele andere Wege, die durch dynamische Proteininteraktionen geregelt zu visualisieren. Das folgende Protokoll bietet schrittweise Anleitungen für die Einführung der Reporter in Zellen sowie Methoden zur Bildaufnahme und Analyse.
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Protocol
1. Vorbereitung der Zellen und Kultur Gerichte
Hinweis: Führen Sie Schritte 1-3 in einer Gewebekultur Laminar-Flow-Haube. Tragen Sie Handschuhe.
- Wenn unten Glasschalen, bestreichen Sie das Glas mit Fibronektin. Fahren Sie mit Schritt 1.2, wenn Kunststoffgeschirr verwenden.
- Machen Sie eine 0,1 mg/mL Lösung von Fibronektin: 1 mL 1 mg/mL Fibronektin Lösung in 9 mL 1 X PBS verdünnen.
- Bedecken Sie den Glasboden von jedem Bohrloch mit 0,5-1 mL Fibronektin und 1-5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Mit einer Pipette, sammeln die Fibronektin-Lösung und Lagerung bei 4 ° C.
Hinweis: Die Fibronektin-Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden. - Das Glas einmal mit 1-2 mL 1 X PBS waschen und aspirieren von PBS.
- Platte 1 x 105 Zellen pro Bohrloch einer 6-Well-Platte in der entsprechenden Zelle 2 mL Kultur Medien (siehe Tabelle 1 für Zellzahlen für verschiedene große Brunnen verwenden). Wenn eine Zelllinie, die stabil die Caspase BiFC Komponenten ausdrückt (siehe Diskussion), Platte 2 x 105 Zellen und fahren Sie mit der Behandlungsschritt (Schritt 3).
- Können Sie Zellen, die Schüssel über Nacht bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator einzuhalten.
2. die Transfektion von Zellen, die Caspase BiFC Komponenten einzuführen
- Transfizieren Sie Zellen mit dem entsprechenden Transfektion Reagenz.
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Anweisungen für Lipofectamine 2000, die für minimale Toxizität optimiert wurde. Dieses Protokoll wird in Hela-Zellen, Zellen MCF7 und LN18 erfolgreich eingesetzt. Wenn zusätzliche Transfektion Reagenzien folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und nach Bedarf zu optimieren.- 750 µL reduzierte Serum Medien in ein steriles Röhrchen 12 µL des Transfection Reagens hinzufügen.
- In 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie 10 ng ein Reporter Plasmid (ein Plasmid Codierung ein fluoreszierendes Protein, z.B. rot fluoreszierende Protein [Ausschreibung], die die transfizierten Zellen beschriften wird) zu einem sterilen 1,5 mL Schlauch für jedes gut zu transfiziert werden.
- Fügen Sie 20 ng jeder Caspase BiFC Plasmids (z. B.20 ng von Caspase-2 prodomain [Pro C2]-VC und 20 ng von C2 Pro-VN) für jedes Rohr (Tabelle 2).
- Bringen Sie jedes Rohr bis zu einem Gesamtvolumen von 100 µL durch Hinzufügen von reduzierten Serum Medien.
- Fügen Sie mit Hilfe einer Pipette p200 hinzu, 100 µL der Transfektion Reagenzlösung aus Schritt 2.1.2 Plasmid-Mischung in gewissem Sinne tropfenweise.
- Inkubieren Sie die Plasmid-Transfection Reagens Mischung für 20 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie die Medien aus den Zellen mit einer Pipette oder mit Absaugung und dann mit einer Pipette p1000 pipette 800 µL Serum freier Medien sanft auf der Seite des Brunnens.
- Fügen Sie mithilfe einer Pipette p200 200 µL der DNA-Lipid-Komplex tropfenweise in jede Vertiefung.
- Inkubieren Sie die Zellen in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C für 3 h.
- Kümmert sich nicht um die Monolage stören, entfernen die Serum freier Medien enthält die DNA-Lipid-komplexe durch Absaugen mit Absaugung oder mit einer Pipette.
- Pipette 2 mL vorgewärmten (37 ° C) komplette Wachstumsmedien sanft an der Seite von jedem Bohrloch.
- Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einer Gewebekultur-Inkubator für 24-48 h für optimale Protein-Expression.
(3) Induktion von Caspase-Aktivierung
- Behandlung mit einem Medikament oder Anregung, die Caspase Aktivierung ca. 24 h nach Transfektion induziert.
- Fügen Sie die gewünschte Konzentration des Medikaments vorgewärmt (37 ° C) bildgebenden Medien (komplette Wachstumsmedien ergänzt mit Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] und 2-Mercaptoethanol [55 µM]) und Mischung sanft (Tabelle 3).
- Aspirieren Sie die Medien aus den Zellen mit einer Pipette oder mit Absaugung und dann mit einer Pipette, pipette, 2 mL der Lösung von 3.1.1 sanft auf der Seite des Brunnens.
- Geben Sie bildgebende Medien ohne die Droge in einer als einer unbehandelten Kontrolle.
- Inkubieren Sie die Zellen in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C oder gehen Sie zu Schritt 4.3 für ein Time-Lapse-Experiment.
4. Caspase BiFC Datenerfassung
-
Caspase BiFC für einzelne Punkt Erwerb
- Schalten Sie das Mikroskop und fluoreszierende Lichtquelle, die Anweisungen des Herstellers.
- Finden Sie die Zellen unter dem RFP Filter und konzentrieren sich auf die Reporter-gen-Fluoreszenz.
- Mit einer Hand-Stückzähler, zählen Sie alle RFP-positiven Zellen im Gesichtsfeld. Notieren Sie die Nummer.
- Unter Beibehaltung der gleichen Gesichtsfeld, wechseln Sie zu der GFP-Filter (oder YFP Filter falls vorhanden) und mit einer Hand-Stückzähler, die Anzahl der Erythrozyten, die auch grün sind (Venus-positiv). Und schalten Sie zwischen den beiden Filtern, um sicherzustellen, dass nur die roten Blutkörperchen für Venus-Positivität ausgewertet werden her. Notieren Sie die Nummer (Abbildung 3).
- Zählen Sie mindestens 100 RFP-positiven Zellen aller drei Einzelbereiche der Platte.
- In jedem Bereich Berechnung des Prozentsatzes der Venus positiven transfizierten Zellen (d.h. Erythrozyten, die auch grün sind). Durchschnitt der sich daraus ergebenden Prozentsätze um die Standardabweichung zu erhalten.
-
Dreidimensionale Bildgebung von Caspase BiFC
- Schalten Sie das Mikroskop nach den Anweisungen des Herstellers und starten Sie der Datenerfassungs-Software zu.
- Wählen Sie die 60 X oder 63 X Öl Ziel und geben Sie einen Tropfen Öl auf das Ziel
- Ort der Kulturschale auf den Mikroskoptisch mit dem richtigen Plattenhalter.
- Mit entweder einem Epifluoreszenz Lichtquelle und das Mikroskop Okular oder die konfokale Laser und dem Computer-Bildschirm, navigieren Sie zu einem Feld von Interesse.
- Konzentrieren Sie sich auf die Reporter-Fluoreszenz der RFP Laser-oder Filter.
- Wenn Epifluoreszenz bis zu diesem Zeitpunkt verwendet wurde, wechseln Sie die Lichtquelle in der konfokalen Laser und visualisieren Sie das live-Bild der Zellen als durch die Kamera erworben und von der Datenerfassungs-Software auf dem Computerbildschirm angezeigt.
- Mit dem Joystick-Steuerung und das Fokussierrad, Feinabstimmung der Fokus und die Position der Zellen so, dass die Zellen in der Mitte des Sucher. Wählen Sie Zellen, die von einander getrennt sind und nicht überlappen.
- Geben Sie die Laserleistung Prozentsatz auf 50 % und die Belichtungszeit bei 100 ms für Venus und RFP als Ausgangspunkt, um die optimalen Einstellungen für das Experiment verwendet zu bestimmen.
- Schalten Sie live erfassen und untersuchen Sie das resultierende Bild und die dazugehörige Anzeige Histogramme für beide Kanäle.
- Wenn das Signal niedrig und das Bild schwer ist auszumachen, erhöhen Sie der Prozentsatz Laser macht und/oder Belichtung Zeit in Schritten, bis das Signal im Bild gut aussieht.
- Stellen Sie sicher, dass das Signal nicht Sättigung erreicht. Überprüfen Sie das Display Histogramm, um sicherzustellen, dass eine deutliche Spitze sichtbar für jeden Fluor ist. Wenn der Gipfel die gesamte Histogrammanzeige umfasst, geben Sie unteren Laser macht und Belichtung Einstellungen (Abbildung 2).
- Visualisieren Sie (unbehandelte oder nicht transfizierten) Kontrollzellen unter den gleichen Bedingungen zu gewährleisten, dass das Signal spezifisch ist.
Hinweis: Einzelne Farbe Transfectants kann auch zur Kontrolle für Crossover, aber wenn die Signale räumlich unterschiedliche (z.B. mitochondriale versus cytosolischen sind) ist dies nicht notwendig. - Wählen Sie oder öffnen Sie das Z-Stapel-Modul in der Mikroskop-Software.
- Verwenden den Fokussierknopf, ungefähre der Fokuslage entspricht der Mitte der Zelle.
- Stellen Sie den Fokus in eine Richtung, bis die Zelle nicht mehr sichtbar ist, wählen Sie diese Option als die Top-Position.
- Stellen Sie den Fokus in die entgegengesetzte Richtung, bis die Zelle wieder nicht mehr sichtbar ist, und wählen Sie diese Option als die untere Position.
- Wählen Sie die optimale Schrittweite (in der Regel ca. 20 µm) und die Übernahme um die Kamera ein Bild automatisch in jedem Kanal jeweils 20 µm Schritte zwischen den oberen und unteren Positionen zu beauftragen.
- Verwenden Sie 3D Rendering-Software, um das 3D Bild (Abbildung 4Film 1) rekonstruieren.
-
Time-Lapse Bildgebung von Caspase BiFC
- Mindestens 1 h vor dem Experiment, schalten Sie das Mikroskop und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.
- Wählen Sie die 40 X, 60 X oder 63 X Öl Ziel und geben Sie einen Tropfen Öl auf das Ziel.
- Ort der Kulturschale auf den Mikroskoptisch mit dem richtigen Plattenhalter.
- Wenn eine CO2 Quelle verfügbar ist, legen Sie die CO2 -Lieferung-Gerät (in der Regel eine Plexiglas Deckel befestigt, die Röhre, die das CO2liefert) auf den Kennzeichenhalter. Der CO-2 -Ebene auf 5 % festgelegt und schalten Sie die CO2 Controller von innerhalb der Software. Wenn eine CO-2 -Quelle nicht verfügbar ist, sind 20 mM Hepes, die Medien zu puffern.
- Navigieren Sie zu einem Feld von transfizierten Zellen und visualisieren Sie das live-Bild der Zellen als durch die Kamera erworben und von der Datenerfassungs-Software auf dem Computer-Bildschirm mit dem RFP Laser angezeigt.
- Geben Sie nach Schritte 4.2.8-4.2.12 die Einstellungen für Prozentsatz Laser Power und Belichtung Zeit für den RFP-Laser. Halten Sie diese Werte so niedrig wie möglich, während noch in der Lage, das Fluoreszenzsignal zu erkennen.
- Mit einer positiven Kontrolle (Beispiele siehe Tabelle 3 ), folgen Schritte 4.2.8-4.2.12, geben Sie die Einstellungen für Prozentsatz Laser macht und Belichtung für das Laserlicht YFP probieren. Halten Sie diese Werte so gering wie möglich, während noch in der Lage, Venus Signal zu erkennen.
- Wählen Sie für jede Vertiefung der Platte eine Anzahl von unterschiedlichen Positionen, die eine oder mehrere Zellen, die mit dem Ausdruck der Reporters enthalten.
- Geben Sie das Zeitintervall zwischen den Einzelbildern Zeitraffer und totale Anzahl der Frames getroffen werden. Stellen Sie sicher, es ist Zeit, um die ausgewählten Positionen zu erwerben, bevor das nächste Bild ist zu achten.
- Jede Position erneut zu besuchen und zu korrigieren und den Fokus bei Bedarf aktualisieren.
- Um für fokale Drift zu korrigieren, die durch Veränderungen in der Temperatur oder externen Vibrationen entstehen können, schalten Sie den Fokus-Drift-Korrektur-System (falls vorhanden).
- Beginnen Sie den Zeitraffer und sichern Sie Ihre Daten.
- Analysieren Sie die Daten über verfügbare imaging-Software (Abbildung 5Movie 2).
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Representative Results
Ein Beispiel von Caspase-2 BiFC durch DNA-Schäden induzierte ist in Abbildung 3dargestellt. Camptothecin, eine Topoisomerase ich Inhibitor, wurde verwendet, um DNA-Schäden und Caspase-2 Aktivierung induzieren. Das rot fluoreszierende Protein mCherry diente als Reporter zu zeigen, dass die Zellen die BiFC Sonde auszudrücken und zu helfen, die Gesamtzahl der Zellen zu visualisieren. Venus Fluoreszenz ist grün dargestellt und die großen Puncta stellen Caspase-2 induziert Nähe. Diese Zellen gezählt werden können, um den Prozentsatz der Venus-positiven Zellen zu bestimmen. Schlussfolgerungen über die subzelluläre Lokalisierung können auch aus solchen Bildern erfolgen. In dem gezeigten Beispiel wurde in der Nukleolus ebenso wie in das Zytoplasma 17Caspase-2 induzierten Nähe nachgewiesen. Um hochauflösende Visualisierung der subzellulären Lokalisierung der komplexen Caspase-Aktivierung zu bieten, können einzelne Zellen dreidimensional dargestellt werden. Abbildung 4 zeigt zwei Möglichkeiten, um solche 3D-Bilder darstellen. Die erste ist eine 3D-Rekonstruktion der Zelle zu generieren. Das Beispiel zeigt die Camptothecin-induzierte Caspase-2 BiFC in grün und rot-Kern. Die 3D Rekonstruktion zeigt die relative Lokalisierung von beiden Fluorophore in die Zellen. Diese Art der Ergebnisanzeige ist besonders wirksam, wenn Sie einen Film drehen der Zelle um eine einzelne Achse (Film 1) vorgestellt. Das zweite Panel ist die orthogonale Ansicht der gleichen Zelle. Dies bietet die Xy, Xzund Yz Visualisierung der Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Zelle. Darstellung der Ergebnisse auf diese Weise kann besser geeignet, um einen Vortrag wie z. B. in einem Fachartikel, da es einfacher ist, die 3D Daten in 2D Format zu interpretieren. Abbildung 5 zeigt ein Beispiel der Zeitraffer Bildgebung von Caspase-2 BiFC in einem Glioblastom-Zelllinie mit Proteasom-Inhibitor Bortezomib behandelt (siehe auch Movie 2). Das Diagramm zeigt die Zunahme der durchschnittlichen Venus Intensität pro Zelle gemittelt über eine Anzahl von Zellen (adaptiert von 20). Diese Art von Daten kann auch als eine Reihe von einzelligen Spuren auf einem Graphen angezeigt werden. In dem gezeigten Beispiel ist das Auftreten von Caspase induzierte Nähe ca. 2 Stunden nach der Behandlung.
Abbildung 1: Schematische Caspase-Struktur und bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung (BiFC) Methodik. (A) allgemeine Struktur von einem Initiator Caspase. Die prodomain, großen und kleinen Untereinheiten und der konservierten QACRG Motiv, das die aktive Website Cystein enthält dargestellt. (B) BiFC verwendet Split fluoreszierende Proteine, die allein sind nicht fluoreszierend, sondern um das fluoreszierende Molekül wenn an interagierenden Proteine fusioniert zu reformieren verbinden können. Für Caspase BiFC, der prodomain (Pro) oder Full-length Caspase ist halb auf der N-terminalen verschmolzen (Venus-N) und die C-terminale Hälfte der Venus (Venus-C). In ihrem Monomere sind die Caspase Fusionsproteine nicht fluoreszierend. Bei der Einstellung zu einer Aktivierung-Plattform, wie die PIDDosome wird wie hier gezeigt Verband die beiden Hälften der Venus erzwungen Caspase induzierte Nähe, die als Erhöhung in Venus Fluoreszenz gemessen wird, darstellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: repräsentatives Bild zur Erkennung von Sättigung mit dem Display Histogramm. Beispiele für optimale (obere Abdeckung) und gesättigten Signale (untere Leiste) werden angezeigt. Die Venus (gelbe Spitze) und RFP (rote Spitze) Signale werden angezeigt. Die x-Achse zeigt die Intensität und die y-Achse ist die Anzahl der Pixel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Caspase-2 bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung (BiFC) nach DNA-Schäden. HeLa-Zellen mit dem Ausdruck Caspase-2 BiFC Komponenten verlassen unbehandelt (A) oder mit Camptothecin (100 µM) behandelt wurden (B) im Beisein von qVD-OPH (20 µM). mCherry wurde als fluoreszierende Reporter Co ausgedrückt. Repräsentative Bilder zeigen Zellen (rot) mit Caspase-2 BiFC (grüne) in Camptothecin-behandelten Zellen 16 h nach der Behandlung. Maßstabsleisten repräsentieren 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Lokalisierung von Caspase-2 bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC). HeLa-Zellen mit dem Ausdruck Caspase-2 BiFC Komponenten und einem fluoreszierenden nuklearen Reporter wurden mit Camptothecin (20 µM) in Anwesenheit von qVD-OPH (20 µM) behandelt. 3D-Rekonstruktionen komponiert von 0,1 μm serielle konfokale Bilder durch die Z-Ebene der Zelle wurden nach 24 h und zeigen den Kern in rot und Caspase-2 BiFC in grün. Der linke Bereich zeigt eine 3D Beihilfehöchstintensität Projektion Rendering Rekonstruktion (siehe auch Film 1). Im Rechte Bereich zeigt den orthogonalen Scheiben Blick auf dieselbe Zelle. Das mittlere Feld (blau) ist die Xy -Ebene und im Rechte Feld (gelb) ist die Yz -Ebene (weiß)-Top-Box ist die Xz -Ebene. Die Yz und Xz Ebenen schneiden nach dem Fadenkreuz. Maßstabsleisten repräsentieren 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Zeitraffer der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung (BiFC) (A) mit der Caspase-2 BiFC Komponenten LN18 Glioblastoma Zellen transfiziert und ein roten fluoreszierenden mitochondriale Marker (DsRed-Mito, rot) mit Bortezomib behandelt wurden (15 nM) im Beisein von qVD-OPH (20 µM). Die Zellen wurden auf einem confocal Mikroskop bei 37 ° C und Bilder wurden alle 2 min für 8 h Bilder von repräsentativen Zellen aus der Time-Lapse-Show, die die induzierte Nähe der beiden Caspase-2 BiFC Komponenten in Venus Fluoreszenz ( stark zugenommen grüne) im Laufe der Zeit. (B) die durchschnittliche Intensität der Venus in jeder Zelle zu jedem Zeitpunkt gemessen wurde. Venus-Fluoreszenz stieg im Laufe der Zeit nach der Behandlung von Bortezomib. Teilung in der unbehandelten Kontrolle angegeben Bedingungen gering oder vernachlässigbar Toxizität von Laserlicht (Abbildung von 20angepasst). Balken repräsentieren 20 µm. Fehler Maßstabsleisten repräsentieren Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 8 (Kontrolle) und 14 (Bortezomib) einzelne Zellen (siehe auch Movie 2). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Größe der Platte | Anzahl der Zellen | Volumen von Medien |
| 6-well-Platte | 1 x 105 Zellen / gut | 2 mL |
| 12-well-Platte | 5 x 104 Zellen / gut | 1 mL |
| 24-well-Platte | 2.5 x 104 Zellen / gut | 0,5 mL |
| 4-Kammer-Gericht | 2.5 x 104 Zellen / Kammer | 1 mL |
| 8 Kammer Gericht | 1,25 x 104 Zellen / Kammer | 0,5 mL |
Tabelle 1: Leitlinien für eine Anzahl von Zellen auf Platte. Wenn Sie Zellen mit dem stabil Ausdruck Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung (BiFC) Komponenten verwenden, Platte verdoppeln die hier ausgewiesenen Beträge.
| Größe der Platte | Transfection Reagens | Reduzierte Serum-Medien | Reporter-plasmid | Caspase-Pro VC plasmid | Caspase-Pro-VN-plasmid | Reduzierte Serum Medien hinzugefügt, um Plasmid-mix | Transfektion Reagenzlösung Plasmid Mischung hinzugefügt | Serum freie Medien zu Zellen hinzugefügt |
| 6-well-Platte | 12 µL/Platte | 750 ΜL | 10 ng | 20 ng | 20 ng | auf insgesamt 100 µL | 100 ΜL | 800 ΜL |
| 12-well-Platte | 12 µL/Platte | 750 ΜL | 5 ng | 10 ng | 10 ng | auf insgesamt 50 µL | 50 ΜL | 400 ΜL |
| 24-well-Platte | 12 µL/Platte | 750 ΜL | 2.5 ng | 5 ng | 5 ng | an insgesamt 25 µL | 25 ΜL | 200 ΜL |
| 4-Kammer-Gericht | 4 µL/Platte | 250 ΜL | 2.5 ng | 5 ng | 5 ng | an insgesamt 25 µL | 25 ΜL | 200 ΜL |
| 8 Kammer Gericht | 4 µL/Platte | 250 ΜL | 1.25 ng | 2.5 ng | 2.5 ng | zu insgesamt 12,5 µL | 12,5 ΜL | 100 ΜL |
Tabelle 2: empfohlene Mengen von Reagenzien für transiente Transfektion. Hinweis: die Höhe der Plasmid vorgeschlagen ist nur ein Ausgangspunkt. Wenn kein Signal erkannt wird, empfiehlt es sich, das Plasmid von 20-200 ng pro Bohrloch einer 6-Well-Platte zu titrieren.
| Caspase | Behandlung | Konzentration | Zeit | Erwartete Ergebnisse |
| Caspase-1 | Stark zum Ausdruck gebrachten ASC | 250 ng/Well des 6-well-Platte | 48 h | 50 % BiFC positiv |
| Caspase-2 | Über ausdrücklichen RAIDD | 500 ng/Well des 6-well-Platte | 24 h | 90 % BiFC positiv |
| Camptothecin | 100 ΜM | 16 h | 30-60 % BiFC positiv | |
| Hitzeschock | 1 h bei 45 ° C | 16 h | 80 % BiFC positiv | |
| Caspase-4 | Überexprimieren NALP1 | 250 ng/Well des 6-well-Platte | 48 h | 30 % BiFC positiv |
| Caspase-5 | Überexprimieren IPAF | 250 ng/Well des 6-well-Platte | 48 h | 15 % BiFC positiv |
Tabelle 3: Beispiele für positive Steuerelemente für Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung (BiFC). Die Bedingungen und die erwarteten Ergebnisse basieren auf veröffentlichten Daten mit dem Pro 14,17,18konstruiert. Co zum Ausdruck gebrachten Plasmide sollte neben den BiFC Plasmiden (Schritt 2.1.4) transfizierten
Movie 1: 3D Lokalisierung von Caspase-2 bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC). 3D Rekonstruktion, drehte sich um die y-Achse der konfokalen Bilder durch die Z-Flugzeug von einem Hela-Zellen mit dem Ausdruck Caspase-2-BiFC Komponenten und einem fluoreszierenden nuklearen Reporter für 16 h mit Camptothecin (20 µM) behandelt wurden. Der Film zeigt Caspase-2 BiFC (grün) und der Zellkern (rot). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Movie 2: Zeitraffer der Caspase-2 bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC). LN18 Glioblastom-Zellen mit der Caspase-2 BiFC Komponenten transfiziert und mit Bortezomib behandelt (15 nm) wurden alle 2 min für 8 h abgebildet. Der Film zeigt Caspase-2 BiFC (grün) und den Mitochondrien (rot). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Split fluoreszierende Proteine, Caspase induzierte Nähe zu messen. Split-Venus wurde für diese Technik gewählt, weil es sehr hell ist, photostabil und die Umfaltung ist sehr schnell 13. So kann die Analyse der Venus Umfaltung auf Caspase induzierte Nähe in der Nähe von Echtzeit-Schätzungen von Caspase Proteindynamik Interaktion bieten. Venus ist aufgeteilt in zwei leicht überlappende Fragmente, die N-Terminus von Venus (Venus-N oder VN) bestehend aus Aminosäuren 1-173 und die C-terminale fragment (Venus-C oder VC) bestehend aus Rückständen 155-239. Anderen Split fluoreszierende Proteine vorhanden sind, aber einige, wie Split mCherry erfordern Inkubation bei 4 ° C für bis zu 2 h für Umfaltung 21. Weitere Split fluoreszierende Proteine einschließlich Cerulean (eine Version von Cyan fluoreszierenden Proteins) aufgeteilt und weit rot geteilten mLumin noch nicht in diesem Kontext 13,22getestet werden. Letztlich, wenn diese fluoreszierende Proteine zur Messung Caspase induzierte Nähe geeignet erweisen, könnte dies für die simultane Auswertung der mehrere Caspasen ermöglichen.
Im Allgemeinen ist die Caspase prodomain (Pro) und Umgebung mit Split fluoreszierenden Fragmente verschmolzen. Diese Region enthält die minimalen Versionen der die Caspase erforderlich, um an die Aktivierung Plattform zu binden und umfasst die Karte oder DED Interaktion-Motiv. Der Vorteil der Verwendung der prodomain ist, dass es enzymatische Aktivität der Zellen keine eingeführt wird. Dies ermöglicht die gleichzeitige Überwachung der nachgeschalteten Ereignisse aufgrund der endogenen Caspase. Forschung bis jetzt hat kaum einen Unterschied in der Kinetik und Lokalisierung von Caspase BiFC zwischen den prodomain und voller Länge Caspase 14gezeigt. Allerdings neigen die Konstrukte, die in voller Länge mit geringerer Effizienz erfordern die Transfektion von erhöhte Mengen von Plasmid DNA zum Ausdruck bringen. Darüber hinaus empfiehlt es sich, die katalytische Cystein, Serin, Caspase-induzierten Apoptose bei Ausdruck zu verhindern mutieren. Trotz dieser Nachteile erfordern bestimmter Untersuchungen die gleichzeitige Analyse der vollen Länge BiFC Paare um festzustellen, ob es Kontext-abhängige Unterschiede in der Nähe der Caspase induziert in der Anwesenheit oder Abwesenheit der katalytische Domänen gibt.
Dieses Protokoll ist speziell für HeLa-Zellen. Das gleiche Protokoll eignet sich gut für zusätzliche adhärenten Zelllinien einschließlich der Mammakarzinom-Zell-Linie, MCF-7, Glioblastom-Zelllinie, LN18 und Maus embryonalen Fibroblasten (MEF). Es wird empfohlen, dass der Benutzer Überzug und Transfektion Bedingungen optimiert, wenn dieses Protokoll zu einer neuen Zelle Art anzupassen. Das Protokoll beschreibt zwei wichtigsten Mikroskopie-Ansätze, die verwendet werden können, um die Zellen zu bewerten: Epifluoreszenz und konfokalen Mikroskopie. Bei der Verwendung von konfokalen Mikroskopie müssen Zellen auf Glasdeckgläser überzogen werden, weil die meisten hoher numerischer Apertur-Ziele, die in Verbindung mit der konfokalen Mikroskopie verwendet werden nicht die Dicke der Plastikschalen oder Glas-Objektträger durchdringen wird. Daher empfiehlt es sich, Speisen mit eingebetteten Nr. 1.5 Glasdeckgläser verwenden, die die optimale Deckglas 0,17 mm Dicke haben. Gibt es eine Reihe von verschiedenen Arten dieser Gerichte, die von einzelnen 3 cm Gerichte, Kammer-Folien zur Standardgröße Multi-well-Platten reichen. Tabellen 1 und 2 beschreiben wie die Beschichtung und Transfektion Anweisungen für gut Größen angepasst. Für die Epifluoreszenz imaging-das ist hier beschrieben (4.1), standard Kunststoff Gewebekultur Platten sind ausreichend, solange das Mikroskop mit langen Pass Zielen ausgestattet ist.
Da dieser Ansatz effektiv eine "Lichter an" Methode zur Messung der Caspase-Aktivierung ist, ist die Einbeziehung eines fluoreszierenden Reporters wesentlich zur Visualisierung der Zellen vor oder in der Abwesenheit der Aktivierung der Caspase-Reporter zu ermöglichen und zu identifizieren die transfected Zellen, wenn transiente Transfektion verwendet wird. Eine Reihe von verschiedenen Reportern verwendet werden kann und das einzige Kriterium bei der Wahl sind: 1) das Fluorophor ist ausreichend hell, so dass es leicht durch die bildgebenden Protokoll; erkannt werden kann und 2) seine Fluoreszenzspektrum überlappt sich nicht mit derjenigen YFP. Beispielsweise sollte grünes fluoreszierendes Protein (GFP) als Reporter nicht verwendet werden, da es durch die YFP Filter oder Laser verwendet, um Venus erkennen erkannt werden. Dies ist auf die spektrale Überlappung der beiden Fluorophore. Wahl einer Fluorophor, die zu einem bestimmten Organell lokalisiert kann zusätzliche qualitative Informationen bereitstellen. Z. B. eines Proteins, dass Ziele die Mitochondrien, wie das rot fluoreszierende Protein DsRed-Mito, zusätzliche Informationen über die gesamte Lebensfähigkeit der Zelle liefern können. Mitochondrien sind in der Regel Fragmentierung (Spaltung) während der frühen Stadien von Zelle Tod 23 unterzogen werden und dies mit einem Reporter wie DsRed-Mito visualisiert werden. Die Verwendung eines Organell-Markers als Reporter können auch Rückschlüsse auf subzelluläre Lokalisation der Caspase BiFC vorgenommen werden.
Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, dass Caspase BiFC Daten und analysiert werden können. Entscheidung über die zu verwendende Methode wird durch die Parameter bestimmt werden, erkundet zu werden (Endpunktanalyse Bevölkerung gegen einzelne Zelle positionelle oder kinetische Informationen) und die Verfügbarkeit von Mess- und imaging-Software. Dieses Protokoll beschreibt ein paar Mikroskop-basierte Ansätze, die Ergebnisse der einen Caspase BiFC Experiment für den Erwerb der einzelnen Zeitpunkten und Zeitraffer-Daten zu sammeln. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass eine Reihe von Variationen und Kombinationen dieser Ansätze verwendet werden, um kreativ Caspase Aktivierung Wege zu verhören.
Einzigen Zeitpunkt Datenerfassung (4.1) wird verwendet, um festzustellen, den Anteil der Zellen mit Caspase induzierte Nähe zu einem einzigen Zeitpunkt. Für dieses Protokoll zählt man einfach die Anzahl der transfizierten Zellen, die Venus-positiv sind. Also, hoch spezialisierter Ausrüstung ist nicht erforderlich und nur die grundlegendsten Epifluoreszenz-Mikroskop mit GFP (oder YFP) und RFP-Filter und eine Hand-Stückzähler erforderlich ist. Einige bildgebenden Systemen können automatisiert werden, um automatisch eine festgelegte Anzahl von Bildern pro Bohrloch einer Platte nehmen. Wenn solche Instrumentierung zur Verfügung steht, die Zellen in der aufgenommenen Bilder können ebenso durch Sichtkontrolle gezählt werden, oder quantitated über imaging-Software. Dreidimensionale Bildgebung (4.2) bietet hochauflösende Bilder von Caspase BiFC während die fokale Flugzeuge der Zelle. Ein confocal Mikroskop mit Lasern, die Venus und RFP (oder der gewählten Transfektion Reporter) begeistern und Z-Stapel-Funktionen erforderlich ist. Eine Reihe von 3D-Rendering Software-Module stehen zur Verfügung, bieten verschiedene Möglichkeiten, um die Daten zu visualisieren. Für beide diese Art von Analyse ist es möglich, die Zellen und das Image zu beheben oder zu einem späteren Zeitpunkt zu beurteilen. Jedoch der Prozess der Fixierung mindert die Venus-Signal, das Elemente der Analyse hinzufügen könnte und daher ist dieser Ansatz nicht empfohlen. Zeitraffer-Bildgebung (4.3) kann verwendet werden, um gleichzeitige kinetische und positionelle Analyse der Caspase BiFC. Ein Mikroskop, ausgestattet mit einem motorisierten Stadium kann Bilder von mehreren Positionen und sogar verschiedenen Behandlungsgruppen im gleichen Experiment vergleichen eingerichtet werden.
Für Zeitraffer, einige zusätzliche Aspekte sollten berücksichtigt werden. Das Laserlicht kann dazu führen, dass Artefakte durch Phototoxizität oder Immunofluoreszenz und sowohl für kontrolliert werden müssen. Im Allgemeinen können beide mit die geringste Menge an Licht (input geringer Prozentsatz Laser Power und kurze Belichtungszeiten in Schritten 4.3.6-4.3.7) vermieden werden. Phototoxizität entsteht, wenn das Licht des Lasers Tod in den Zellen induziert und durch imaging unbehandelte Zellen unter den gleichen Bedingungen und bestätigen, dass die Zellteilung geht wie gewohnt gesteuert werden. Immunofluoreszenz tritt auf, wenn mehrere Aufnahmen der gleichen Zelle verringert die Fluoreszenz. Das fluoreszierende Protein Venus ist ganz photostabil, so dass dies ein Problem in der Praxis selten ist. Die Auswirkungen der Immunofluoreszenz können ermittelt werden, von zahlreichen aufeinander folgenden Bildern einer Venus-positiv-Zelle und dafür zu sorgen, dass die Fluoreszenz stabil bleibt. Dies muss nur einmal durchgeführt werden, solange die gleichen Laser Power und Belichtung Einstellungen für jedes Experiment verwendet werden. Verringerung der Gesamtzahl der aufgenommenen Bilder können auch Effekte durch Phototoxizität oder Immunofluoreszenz gemildert werden. Dies kann erreicht werden durch Verlängerung oder Verkürzung den zeitliche Abstand zwischen den Aufnahmen (Schritt 4.3.9). Mit 5-10 min Intervallen über einen 16 h Zeitraffer ist ein guter Ort um zu starten. Wenn keine Photoxicity beobachtet oder Experimente von kürzerer Dauer erforderlich sind, kann das Intervall zwischen den Frames reduziert werden. Wenn Caspase Aktivierung schnell ist, können kürzere Experimente mit kürzeren Zeitabständen verwendet werden. Zum Beispiel für ein 16 h Experiment mit 10 min-Takt, insgesamt 192 Bilder (96 für jedes Fluorophor) erfolgt. Eine 2 h-Experiment mit 1,5-Meter-Intervallen werden 160 Bilder ergeben. Daher würden die lange und kurze Experimente jeweils die Zellen ähnliche Gesamtbeträge der Laser-Licht aussetzen. Für kurze Dauer Experimente kann die Caspase Aktivierung Impulse direkt an die Medien unmittelbar vor der Einweihung der Zeitraffer-Aufnahme (nach 4.3.11 anstelle von Schritt zu Schritt 3) hinzugefügt werden. Um dies zu tun, entfernen Sie den Deckel von der Platte und fallen Sie sanft in eine Lösung mit der Reiz mit einer Pipette. Achten Sie darauf, nicht drängeln sich die Platte und schnell überprüfen, dass die Zellen immer noch im Fokus, bevor Sie fortfahren.
Bei der Durchführung Zeitraffer Experimente ist es auch wichtig, um sicherzustellen, dass die unmittelbare Umgebung der Zellen ähnelt der einer Gewebekultur Inkubator. Eine Reihe von Umweltkontrollen stehen auf verschiedenen Mikroskop Set Ups. Dazu gehören kleinere Bühne Top Inkubatoren sowie Klimakammern, die das gesamte Mikroskop Kapseln. Beide Geräte liefern in der Regel Wärme, CO2und Feuchtigkeit an die Kammer in einer Weise, die exakt gesteuert werden kann. Die präzise Steuerung der CO2 und Temperatur ist entscheidend für den Erfolg des Experiments, weil unerwartete Temperatur Schwankungen können zu fokalen Drift und Fehlen von CO2 führen den pH-Wert des Mediums steigen verursacht, die zu den Zellen giftig sein können. Wenn eine CO2 -Quelle nicht verfügbar ist, können die Medien durch die Zugabe von Hepes gepuffert werden (siehe Punkt 3.1.1). Auch wenn eine CO2 Quelle verfügbar ist, empfiehlt es sich, Hepes gehören bildgebende mittelfristig als zusätzliche Maßnahme, um die Zellen gesund zu halten. Das Fehlen von CO2 über einen längeren Zeitraum hinweg kann jedoch auch in Gegenwart von Hepes, Zelltod führen. Daher ist es wichtig, inspizieren unbehandelte Zellen abgebildet unter den gleichen Bedingungen, und die Farbe der Medien am Ende des Experiments um sicherzustellen, dass der pH-Wert stabil geblieben ist. Beachten Sie, dass das Phenol rot muss nicht verzichtet werden, aus den Medien, die in diesem Protokoll verwendet, da der Beitrag der Autofluoreszenz des Venus-Signals minimal ist.
Es gibt eine Reihe von Methoden, die Bilddaten aus einer Zeit verfallen Experiment zu analysieren. Messung der mittleren Intensität der Venus Pixel pro transfizierten Zellen ist der direkteste Weg um das Timing der Caspase induzierte Nähe zu analysieren. Wie in Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5gezeigt, erscheint die Caspase-2 BiFC oft als ein oder mehrere Puncta befindet sich in verschiedenen subzelluläre Kompartimente. Bildgebende Analyse nähert, dass Taktzahlen Brennpunkte, Objektgröße oder zusätzliche ähnliche Faktoren informative quantitative Daten über diese Strukturen führen können. Nicht alle Caspase erscheint BiFC als Puncta. Zum Beispiel haben die inflammatorischen Caspasen verschiedene BiFC Musterung einschließlich diffuse Fluoreszenz, faserigen Strukturen und einzelne oder mehrere Puncta pro Zelle 18gezeigt. Diese Muster waren die sowie die vorgelagerten aktivierende Signale aktiviert Caspase abhängig. Daher wird die Art der Analyse, die für die Zeitraffer-Ergebnisse am geeignetsten ist weitgehend durch die Art der fluoreszierende Muster diktiert werden, die beobachtet wird.
Viele der Behandlung Stimuli, die festgesetzt werden, wenn unter Verwendung dieses Protokolls Apoptose entweder direkt durch die Caspase analysiert, oder indirekt durch die Einbindung eines anderen Zelle Tod Weges induziert wird. Dies bewirkt, dass die Zellen schrumpfen und trennen Sie die Platte, die macht es sehr schwierig, die Zellen zu Bild und fast unmöglich, jede konkrete Lokalisierung von Caspase-BiFC zu bestimmen. Aufnahme von einem Pan-Caspase Inhibitor wird dieser Zelltod verhindern. Die Rekrutierung von Caspasen zu ihrer Aktivierung-Plattformen und die damit verbundenen Caspase BiFC ist nicht abhängig von der katalytischen Aktivität von der Caspase. Daher Caspase Hemmung wirken sich nicht auf diesen Schritt, aber die nachgelagerten physikalischen Eigenschaften der Apoptose einschließlich Blebbing, Ablösung und eventuellen Verlust in Plasmamembran Integrität zu hemmen. Deshalb wenn Endpunktanalyse (Schritt 4.1) oder Z-Stapel (Schritt 4.2) durchführt, die Aufnahme von einem Caspase Inhibitor unerlässlich. Für Zeitraffer Experimente im Gegensatz dazu wenn Apoptose-Veranstaltungen wie MOMP, annexin V Bindung (Phosphatidyl-Serin Exposition zu erkennen) oder Propidium Jodid Aufnahme (Plasmamembran Permeabilisierung zu erkennen) sind neben Caspase BiFC, analysiert werden die Caspase-Hemmer sollte unterbleiben, Hemmung dieser Ereignisse zu verhindern. Ein Caspase-Hemmer wie qVD-OPh (10-20 µM) sollte in den Medien hinzugefügt werden, die die Apoptose-induzierende Reiz (Schritt 3.1.1) enthält. Wenn ein Pro-apoptotische Protein mit den Caspase BiFC Komponenten Co zum Ausdruck zu bringen, sollte die Caspase-Inhibitor bei Schritt 2.1.12 hinzugefügt werden.
Caspase BiFC ist eine der wenigen verfügbaren Methoden, die verwendet werden, um Ereignisse in Caspase Aktivierung Bahnen in lebenden Zellen zu visualisieren, muss eine Reihe von Überlegungen berücksichtigt werden bei der Gestaltung dieser Experimente. Da dieser Ansatz auf Überexpression basiert, sind Kontrollen für Spezifität wichtig. Dies kann auf zwei Arten erfolgen. Einführung von einheitlichen Punktmutationen in der Karte oder dem DED die Caspase prodomain, so dass sie die Bindung zwischen der Caspase und seine Aktivierung Plattform stören sollte zunächst die Intensität der Caspase BiFC und der Prozentsatz der Venus positiven verringern. Zellen. Zum Beispiel Mutation des Rückstands D59 bis E im prodomain der Caspase-1 stört Bindung an den Adapter Protein ASC (Apoptose-assoziierten Speck-Like Protein enthält eine Karte) und ebenso stört die ASC-induzierte Caspase-1 BiFC 18,24 . Zweitens verringert die Verwendung von Zellen, die einen Mangel an die Adapter-Proteine sind, die die Caspase zur Aktivierung Plattform rekrutieren spezifische BiFC Signale. Dies kann erreicht mit Ko-Zellen, falls vorhanden, oder mit SiRNA oder CRISPR/Cas9-basierte Ansätze, um die Zellen des Adapters zum Abbau. Entsprechend, Abbau des Proteins Caspase-2 Adapter RAIDD komplett gesperrt Caspase-2 BiFC induziert durch Hitzeschock oder DNA-Schaden 14,17. Für diese Experimente Ko oder Knockdown Zellen mit aufeinander abgestimmten Steuerung Zellen (d.h. Wurf abgestimmt Wildtyp MEF oder Kontrolle Knockdown) verglichen werden sollten und wenn eine neue Zell-Linie verwendet wird, sollte optimale Transfektion Bedingungen bewertet werden, um gleich zu gewährleisten Ausdruck der BiFC Reporter über Zell-Linien.
Eine zweite Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass bei der Verwendung von transiente Transfektion es schwierig sicherzustellen ist, dass jede Zelle gleiche Mengen an jedes Protein ausdrückt. Wenn Ausdruck ungleich ist, könnte ein Venus-Fragment der Plattform bei höheren Frequenzen eingestellt werden. Das volle Fluoreszenzsignal zu maskieren, und könnte zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Um dieses Problem zu überwinden, wurde eine neue Version von Caspase BiFC Reporter für stabile Linie Zellgeneration kürzlich berichtet 17. Diese neue Version bestand aus einem Konstrukt, das die C2 Profi-BiFC-Komponenten auf einen einzigen offenen Leseraster getrennt von den viralen 2A selbst anhaftenden Peptid 25ausgedrückt. Daher sind die BiFC Komponenten transkribiert als einen einzigen mRNA vom gleichen Veranstalter aber übersetzt, um stoichiometrically gleiche Mengen von VC und VL Fusionsproteine zu produzieren. Die Zell-Linien generiert, um dieses Konstrukt stabil express zeigten ähnliche Tendenzen der Aktivierung, die vorübergehend zum Ausdruck gebrachten Reporter aber waren empfindlicher und angezeigten Hintergrundfluoreszenz zu senken. Somit kann die oben genannten Protokoll erheblich vereinfacht werden, wenn in Verbindung mit Reporter Zelllinien verwendet, die stabil die Caspase BiFC Komponenten ausdrücken.
Daten zu Datum vorschlagen minimalen Interferenz zwischen den Caspase BiFC Komponenten und die körpereigene Proteine. Z. B. Caspase-2 ist bekanntermaßen aktivierten stromaufwärts des MOMP aber Caspase-2 BiFC nicht blockieren, das Fortschreiten der MOMP 14. So erscheinen diese Reporter nicht dominant negativen handeln. Allerdings sollte wenn gleichzeitig nachgelagerte Veranstaltungen bewerten, dies innerhalb jedes Satzes von Experimenten untersucht werden. Einschließlich eines Steuerelements transfiziert gut im Experiment ist der beste Weg, diesen Ansatz. Wenn die Kinetik der Zelltod unverändert mit oder ohne Ausdruck des Caspase-Sensors sind, wird dies bedeuten, dass die Caspase-BiFC Komponenten endogene Funktion nicht beeinträchtigt werden. Umgekehrt könnte der endogenen Caspase möglicherweise das BiFC auslesen, Effizienz oder in der Größe oder Form der Strukturen beeinflussen. Mit dem Ausdruck der Reporters in den Zellen mangelhaft für die Caspase wird dafür Steuern.
Trotz dieser Einschränkungen ist die Caspase BiFC Technik eine nützliche Methode, Caspase Aktivierung Wege zu befragen, die ergänzen und sogar auf bestehende Ansätze zur Messung der Initiator Caspase Aktivierung verbessern können. Durch Messung induzierte Nähe, der erste Schritt bei Aktivierung, überwindet diese Technik Probleme im Zusammenhang mit späteren Messschritte wie Caspase Auto-Verarbeitung mit Aktivierung verbunden. Zum Beispiel während die Spaltung der Henker Caspasen Überwachung mit western-Blot, bietet Caspase-3 und Caspase-7 eine genaue Messung der Aktivierung 2, mit dem gleichen Ansatz für Initiator Caspasen fehlerhaft sein können. Und zwar deshalb, weil die Spaltung der Initiator Caspasen, reicht nicht aus, für die Aktivierung 4,26,27. In der Tat sind viele Initiator Caspasen während der Apoptose durch Caspase-3 gespalten ohne aktive Enzyme 28zu produzieren. Ebenso müssen Techniken, basierend auf mit Peptid-Substrate, die als Ziele für bestimmte Caspasen konzipiert die überlappenden Besonderheiten dieser Sequenzen der Caspasen 29berücksichtigen. Dies bedeutet nicht, dass solche Ansätze nicht zur Aktivierung der Caspase Messen verwendet werden, aber die Nachteile sollten bei der Interpretation der Ergebnisse anerkannt werden. Caspase BiFC bietet eine alternative Methode, die helfen können Ergebnisse, die mit herkömmlichen Methoden bestätigen. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, die Versammlung der Caspase-Aktivierung-komplexe in Echtzeit verfolgen und deutlich bestimmen die Größe, Form und Lokalisation der komplexe ein wesentlicher Vorteil dieser Technik, die nicht durch andere Mittel zu beurteilen ist.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir möchten alle bisherigen Mitglieder des Bouchier-Hayes Lab zu würdigen, die für die Entwicklung dieser Technik beigetragen. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Texas Children Hospital Pediatric Pilot Award, LBH finanziert. Wir danken für die Erlaubnis, in Zusammenarbeit mit ihrem Team veröffentlichte Daten gehören Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas). Die Entwicklung der beschriebenen Reagenzien wurde durch die Zytometrie und Zellkern Sortierung am Baylor College of Medicine unterstützt mit Mitteln aus dem NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 und NCRR S10RR024574) und die Unterstützung des Joel M. Sederstrom
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
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