Lysa upp vägarna till kaspas aktiveringen med Bimolecular fluorescens komplettering
Summary
Det här protokollet beskriver kaspas Bimolecular fluorescens komplettering (BiFC); en tänkbar metod som kan användas för att visualisera inducerad närheten av initieraren kaspaserna, vilket är det första steget i deras aktivering.
Abstract
Kaspas familjen av proteaser spelar viktiga roller i apoptos och medfödd immunitet. Bland dessa, en undergrupp som kallas initieraren kaspaserna är de första att aktiveras i dessa vägar. Denna grupp omfattar kaspas-2, -8, -9, samt inflammatoriska kaspaserna, kaspas-1, -4 och -5. Initieraren kaspaserna är alla aktiveras av dimerization efter rekryteringen till specifika multiprotein komplex som kallas aktivering plattformar. Kaspas Bimolecular fluorescens komplettering (BiFC) är ett imaging synsätt där delade fluorescerande proteiner smält till initieraren kaspaserna används för att visualisera rekrytering av initieraren kaspaserna deras aktivering-plattformar och den resulterande inducerad närhet. Denna fluorescens ger en avläsning av en av de tidigaste steg som krävs för initieraren kaspas aktivering. Använder ett antal olika mikroskopi-baserat tillvägagångssätt, kan denna teknik ge kvantitativa uppgifter om effektiviteten av kaspas aktivering på befolkningsnivå samt kinetiken för kaspas aktivering och storlek och antal kaspas aktivera komplex på basis per cell.
Introduction
Familjen kaspas proteas är kända för sina kritiska roller i apoptos och medfödd immunitet 1. På grund av sin betydelse, bestämma när, var och hur effektivt specifika kaspaserna aktiveras kan ge viktiga insikter i mekanismerna för kaspas aktiveringen vägar. Imaging baserade protokollet beskrivs här möjliggör visualisering av tidigaste stegen i kaspas aktiveringen kaskad. Denna teknik tar fördel av de dynamiska protein: protein interaktionerna att driva kaspas aktivering.
Kaspaserna kan delas in i två grupper: initiativtagare kaspaserna (kaspas-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 och -12) och bödeln kaspaserna (kaspas-3, -6 och -7). Bödeln kaspaserna är närvarande i cellen som förformade dimerer och aktiveras genom klyvning mellan stora och små subuniten 2. När aktiverad, klyva de många strukturella och reglerande proteiner som leder till apoptos 3. Initieraren kaspaserna är första kaspaserna att aktiveras i en väg och allmänt utlösa aktivering av bödeln kaspaserna. I motsats till bödeln kaspaserna aktiveras initiativtagare kaspaserna av dimerization 4,5. Denna dimerization underlättas genom rekrytering av inaktiva monomerer till specifika stor molekylvikt komplex kallas aktivering plattformar. Montering av aktiveringen plattformar styrs av en rad specifika protein: protein interaktioner. Dessa förmedlas av bevarat protein interaktion motiv i den proform av de initierare kaspas och inkluderar döden domän (DD), döden effektor domän (DED) och kaspas rekrytering domän (kort) 6 (figur 1A). Aktivering plattformar omfattar i allmänhet en receptorprotein och en adapter protein. Receptorn aktiveras vanligtvis vid bindning av en ligand, förmå en conformationaländring som möjliggör oligomerisering av många molekyler. Receptorn sedan rekryterar antingen den kaspas direkt eller adapter molekyler som i sin tur leda till kaspas till komplex. Således komma många kaspas molekyler i närheten som tillåter dimerization. Detta är känt som den inducerade närhet modell 7. När dimerized, genomgår kaspas autoprocessing, som tjänar till att stabilisera den aktiva enzym 4,8. Exempelvis utlöses montering av den Apaf1 apoptosome av cytokrom c efter dess frigörare från mitokondrierna i en process som kallas mitokondriell yttre membran permeabilisering (MOMP). Apaf1 rekryterar i sin tur kaspas-9 genom en interaktion som medieras av ett kort som är närvarande i båda proteiner 9. Liknande proteininteraktioner resultera i montering av CD95 döden inducerande signalering komplexa (skiva) som leder till kaspas-8 aktivering; den PIDDosome, som kan aktivera kaspas-2; och olika inflammasome komplex som initiera kaspas-1 aktivering 10,11,12. Således, initiativtagare kaspaserna rekryteras till specifik aktivering plattformar av en gemensam mekanism som resulterar i inducerade närhet och dimerization, utan vilken aktiveringen inte kommer att inträffa.
Kaspas Bimolecular fluorescens komplettering (BiFC) är en imaging-baserade analysmetod som utvecklats för att mäta detta första steg i aktiveringen av initieraren kaspaserna, så att direkt visualisering av kaspas inducerad närhet efter aktiveringen plattform montering. Denna metod utnyttjar egenskaperna av split fluorescerande protein Venus. Venus är en ljusare och mer fotostabilt version av gula fluorescerande protein (YFP) som kan delas in i två icke-fluorescerande och något överlappande fragment: N-terminalen av Venus (Venus N eller VN) och C-terminus Venus (Venus C eller VC). Dessa fragment kvar möjligheten att refold och blir fluorescerande när i närheten av 13. Varje Venus fragment smälts på den prodomain av den kaspas, som är den minimal del av den kaspas som binder till aktiveringen plattformen. Detta säkerställer att kaspaserna behåller inte enzymatisk aktivitet och därför samtidig analys av efterföljande händelser associerade med endogena händelser är möjligt. Venus fragment refold när kaspas prodomains rekryteras till aktiveringen plattformen och genomgå inducerad närhet. (Figur 1B). Den resulterande Venus fluorescensen kan användas för att noggrant och särskilt övervaka subcellulär lokalisering, kinetik och effektiviteten i montering av initieraren kaspas aktiveringen plattformar i enstaka celler. Imaging data kan förvärvas genom konfokalmikroskopi eller standard fluorescensmikroskopi och kan anpassas till ett antal olika mikroskopi metoder inklusive: time-lapse imaging för att spåra kaspas aktivering i realtid; hög upplösning imaging för exakta bestämningar av subcellulär lokalisering; och slutpunkten kvantifiering av aktiveringen effektivitet.
Denna teknik utvecklades först för att undersöka aktivering av kaspas-214. Medan den aktivering plattformen för kaspas-2 tros vara PIDDosome, som består av receptorn PIDD (p53-inducerade protein med en död domän) och adapter RAIDD (RIP-associerade ICH-1/CAD-3 homologa protein med en död domän), PIDDosome-oberoende kaspas-2 aktivering har rapporterats. Detta tyder på att ytterligare aktivering plattformar för kaspas-2 finns 15,16. Trots att inte veta full komponenterna av kaspas-2 aktivering plattformen, har kaspas BiFC teknik möjliggjort framgångsrika förhör av signalvägar som kaspas-2 på molekylär nivå 14,17. Vi har också framgångsrikt anpassat detta protokoll för inflammatoriska kaspaserna (kaspas-1, -4, -5 och -12) 18 och, i princip samma tillvägagångssätt bör räcka till på samma sätt analysera varje återstående initieraren kaspaserna. Detta protokoll skulle likaså kunna anpassas att undersöka andra vägar var dimerization är en viktig aktiverande signal. Exempelvis aktiveras STAT proteiner av dimerization efter fosforylering av Janus kinase (JAK) 19. BiFC systemet kan således användas för att visualisera för STAT aktivering samt många andra vägar som regleras av dynamiska proteininteraktioner. Följande protokoll ger stegvisa instruktioner för införandet av reportrar i celler samt metoder för bild förvärv och analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll diskuterar användningen av split fluorescerande proteiner att mäta kaspas inducerad närhet. Split Venus valdes för denna teknik eftersom det är mycket ljus, mycket fotostabilt och den vika är snabb 13. Analysen av Venus vika vid kaspas inducerad närhet kan således ge nära realtid anseende av kaspas protein interaktion dynamics. Venus är uppdelat i två något överlappande fragment, N terminalen av Venus (Venus-N eller VN) som består av aminosyror 1-173 och C terminalen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill uppmärksamma alla tidigare medlemmar i Bouchier-Hayes labbet som bidragit till utvecklingen av denna teknik. Detta arbete finansierades delvis av en Texas Children’s Hospital Pediatric Pilot award till LBH. Vi tackar Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) om tillstånd att inkludera data publiceras i samarbete med hennes team. Utvecklingen av de reagens som beskrivs stöddes av flödescytometri och Cell sortering Core vid Baylor College of Medicine med finansiering från NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 och NCRR S10RR024574) och hjälp av Joel M. Sederstrom
Materials
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don’t know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
