腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成: 同定及び定量化の手法
Summary
このプロトコルにより、腸管病原体の付着、細胞外高分子物質マトリックス形成を評価することによって細菌のバイオ フィルムの動的な性質をキャプチャする多面的なアプローチを使用しての胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成を分析するリーダー分散。
Abstract
バイオ フィルム形成は、過酷な環境条件やストレスの時代下で細菌が発生するダイナミック ・多段階のプロセスです。胃腸管内輸送中と胆汁の露出、人間の消化の法線成分に腸内病原体の重要なストレス反応が誘起されます。胆汁の殺菌効果を克服するためには、多くの腸病原体は、小腸を通過するときに生存を許可するいると仮定バイオ フィルムを形成します。固相の付着試金と同様に細胞外高分子物質 (EPS) マトリックス検出と可視化によるバイオ フィルム形成を定義するための方法論をご紹介します。さらに、バイオ フィルム分散評価が感染プロセス中に細菌のリリースをトリガーするイベントの解析を模倣するように表示されます。クリスタル バイオレット染色、高スループット 96 ウェル プレートの付着試験で付着性細菌を検出するために使用されます。EPS 生産評価、すなわち 2 つの試金によって決まります顕微鏡 EPS 行列と多糖類の蛍光共役結合レクチンと半定量分析の染色します。最後に、コロニー カウントとめっきによるバイオ フィルムの分散を測定します。複数のアッセイから肯定的なデータは、バイオ フィルムの特性をサポートし、他の菌株による胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成を識別するために利用することができます。
Introduction
バイオ フィルム形成は、過酷な環境条件の中に誘起される重要な細菌の生存戦略です。殺菌の化合物への露出のように抗生物質や栄養の変化または酸素可用性がバイオ フィルム形成によって軽減することができます細菌のストレス状態を誘導します。バイオ フィルムは、サーフェスまたは他の細菌に細菌の付着によって特徴付けられるし、多糖類1,2,3の主にで構成される EPS 行列の分泌を伴います。バイオ フィルム形成はダイナミックなプロセスでイベントのカスケード成熟した付着性を有する細菌群集1,2,3の形成で絶頂に達する。細菌アドヘシン成熟バイオ フィルムの中に添付ファイルを強化する付着性遺伝子発現プロファイルをシフトさせながら初期添付ファイルを容易にするを生成します。同時に、EPS の生産は初期のストレスから細胞を保護するために行列に細菌群集のコートに発生します。バイオ フィルム内の細菌は、成長が遅い。そのため、レンダリングのほとんどの抗生物質は効果がないと。さらに、低成長は、細菌の増殖1,2,3を支持する条件を変更するまで、エネルギーを節約します。過酷な条件が過ぎた後、細菌はバイオ フィルムを分散し、浮遊性ライフ スタイル1,2,3を再開します。従来、バイオ フィルムは表面に観察される、感染貯水池カテーテルと住居のデバイス1,2,3に存在のための永続的な臨床的課題を表します。
バイオ フィルム形成最近述べたいくつかの腸病原体;小腸または結腸4感染細菌。赤痢菌種、の感染は人間のコロンの消化管の大部分を通過後に発生します。小腸を通過、中に赤痢菌が胆汁; にさらされています。同時にほとんどの細菌5を殺しながら、脂質の消化を容易にするために腸に分泌される脂質分解洗剤です。腸内の病原体は、胆汁6の殺菌の効果に抵抗するユニークな能力を持っています。私たちの最近の分析は生体内で活用-グルコースとs. 菌で堅牢なバイオ フィルム形成を示すため胆汁酸塩の組み合わせだけでなく、赤痢菌、病原性大腸菌、およびの他の種のようにサルモネラ4。以前は、サルモネラ血清型慢性感染症7,8,9,中に胆嚢のユニークな植民地化のため胆汁によるバイオ フィルムを形成する発疹チフスを示した10.11ビブリオカンピロバクター12先行研究が胆汁に対するバイオ フィルム形成を実証するさらに、します。したがって、分析は他の病原体に胆汁によるバイオ フィルム形成観察を拡張、胆汁に保存された腸内病原体応答のデモを確立するのに役立ちます。慢性的なバイオ フィルム細菌の遺伝子の転写は限られているし、細胞老化は1,2,3を発生することが, とは異なり腸胆汁によるバイオ フィルムがより本質的に一時的である提案します。この過渡病原性バイオ フィルムはように品質証明され急速な分解 (分散分析で見られる) と、バイオ フィルムの人口4,6で観察された病原性遺伝子発現を強化します。
バイオ フィルム形成は多面的なダイナミックなプロセス、および胆汁酸塩の使用開始因子が最近最も腸内病原体の説明だけされて、ツールやテクニックを使用は、従来の方法のユニークで創造的なアプリケーションです。したがって、ここでは胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成、バイオ フィルムから細菌付着、EPS 行列の生産と生菌数の分散を含むいくつかの重要な特徴を定量化するための 3 つの無料戦略。これらのテクニックは、赤痢菌の研究に主に利用されています。したがって、他の腸管病原体の評価が最適化を必要とします。それにもかかわらず、3 つすべてのアッセイから肯定的なデータはバイオ フィルムの識別をサポート、胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成の再現可能なプロトコルを確立します。
Protocol
Representative Results
Discussion
バイオ フィルム形成の分析は、バイオ フィルムとアッセイ研究所、材料株間変動の動的な性質のために挑戦です。ここでは、再現性を促進するために提供される実験的洞察力と胆汁酸塩の露出に続く腸管病原体のバイオ フィルム形成を決定するいくつかの方法が掲載されています。再現性を確保するための追加の考慮事項があります。第一に、それぞれの観測と発生する変動の統計的有意?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
テクニカル サポート、レイチェル B. チャニンとアレハンドロ リャノス Chea に感謝します。本研究で使用される系統、アンソニー ・ t. Maurelli、ブライアン p. ハーレー、アレッシオ ファザーノ、ブレット E. Swierczewski とボビー Cherayil に感謝します。この作品は、国立研究所のアレルギーと感染疾患グラント K22AI104755 (C.S.F.) によって支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
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