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Imunologia e Infecção

Formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos: técnicas para la identificación y cuantificación

Published: May 06, 2018
doi:
10.3791/57322
,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics,Harvard Medical School

Summary

Este protocolo permite al lector a analizar la formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos usando un enfoque multifacético para capturar la naturaleza dinámica de los biofilms bacterianos mediante la evaluación de adherencia, formación de la matriz de sustancias poliméricas extracelulares, y de dispersión.

Abstract

Formación de biopelículas es un proceso dinámico y gradual que se produce en bacterias bajo condiciones ambientales difíciles o momentos de estrés. Para patógenos entéricos, se induce una respuesta de estrés importante durante el tránsito gastrointestinal y a la exposición de la bilis, un componente normal de la digestión humana. Para superar los efectos bactericidos de la bilis, muchos patógenos entéricos forman una biopelícula que se presumen para permitir sobrevivir al tránsito por el intestino. Aquí presentamos metodologías para definir la formación de biopelículas a través de ensayos de fase sólida adherencia así como detección de la matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y visualización. Además, se presenta evaluación de dispersión de biofilm para imitar el análisis de eventos desencadenar liberación de bacterias durante el proceso de infección. Tinción de cristal violeta se utiliza para detectar bacterias adherentes en un ensayo de adherencia de la placa de 96 pozos de alto rendimiento. Evaluación de producción de EPS está determinada por dos ensayos, a saber, microscopía de tinción de la matriz EPS y análisis semicuantitativo con una lectina de polisacárido conjugado fluorescente. Por último, dispersión de biofilm se mide a través de recuentos de colonias y chapado. Datos positivos de ensayos múltiples apoyan la caracterización de biopelículas y pueden ser utilizados para identificar la formación de biopelículas inducida por sales biliares en otras cepas bacterianas.

Introduction

Formación de biofilms es una estrategia importante de supervivencia bacteriana inducida durante duras condiciones ambientales. Exposición a compuestos bactericidas como antibióticos o cambios en los nutrientes o la disponibilidad de oxígeno induce un estado de estrés en las bacterias que pueden ser aliviadas a través de la formación de biopelículas. Una biopelícula se caracteriza por el accesorio de bacteria a una superficie o a otras bacterias y se acompaña de la secreción de la matriz de EPS conformada principalmente por polisacáridos1,2,3. Formación de biopelículas es un proceso dinámico en el que una cascada de eventos culmina en la formación de una comunidad bacteriana adherente madura1,2,3. Las bacterias producen adhesinas para facilitar el apego temprano mientras cambio de perfiles de expresión génica de adhesina para fortalecer el apego durante la maduración de la biopelícula. Al mismo tiempo, ocurre la producción de EPS para cubrir la comunidad bacteriana en una matriz para proteger las células contra el estresor inicial. Bacterias dentro del biofilm son de crecimiento lento; y como tal, la mayoría antibióticos ineficaces. Además, el lento crecimiento conserva energía hasta que las condiciones cambien para favorecer el crecimiento bacteriano1,2,3. Después de las duras condiciones, las bacterias dispersan el biofilm y reanudar un estilo de vida planctónica1,2,3. Tradicionalmente, los biofilms se observan en las superficies y representan un desafío clínico persistente debido a depósitos de infección en catéteres y en la vivienda aparatos1,2,3.

Formación de biofilms fue descrita recientemente por varios patógenos entéricos; bacterias que infectan el intestino delgado o colon4. Para las especies de Shigella , la infección ocurre en el colon humano después de un tránsito a través de la mayoría del tracto gastrointestinal. Durante el paso por el intestino, Shigella se expone a la bilis; un detergente de degradar lípidos secretado en el intestino para facilitar la digestión de lípidos mientras que simultáneamente mata la mayoría de las bacterias5. Patógenos entéricos tienen una capacidad única de resistir los efectos bactericidos de bilis6. Nuestro análisis recientes utilizaron en vivo-como combinaciones de glucosa y las sales biliares para demostrar formación de biofilm robusto en S. flexneri , así como otras especies de patógenos Shigella, Escherichia coliy Salmonella4. Previamente, Salmonella enterica serovar Typhi fue demostrado para formar un biofilm inducida por bilis debido a la colonización única de la vesícula biliar durante la infección crónica7,8,9, 10. Además, investigaciones previas con Vibrio11y Campylobacter12 demostraron la formación de biofilm en respuesta a la bilis. Por lo tanto, los análisis amplió las observaciones de la formación de biofilm inducida por bilis a otros patógenos y ayudan a establecer la demostración de una respuesta patógeno entérico conservado a bilis. A diferencia de la crónica biofilms que transcripción genética bacteriana limitada y senescencia celular puede ocurrir1,2,3, proponemos que el biofilm inducida por bilis entérico es más transitorio en naturaleza. Este transitorio, biofilm virulento se caracteriza por un desmontaje rápido (como se ve en el análisis de dispersión) y una mayor expresión de genes de virulencia en la biopelícula población4,6. 

Formación de biopelículas es un proceso multifacético, dinámico y el uso de las sales biliares como un factor de iniciación sólo ha sido recientemente descrito por patógenos entéricos más, las herramientas y técnicas utilizadas son únicas y creativas aplicaciones de los métodos tradicionales. Por lo tanto, aquí se presentan tres estrategias gratuitas para cuantificar varias características importantes de la formación de biofilm inducida por sales biliares, incluyendo la adherencia bacteriana, producción de la matriz EPS y la dispersión de bacterias viables del biofilm. Estas técnicas se han utilizado principalmente para la investigación con Shigella; y por lo tanto, la evaluación de otros patógenos entéricos puede requerir optimización. Sin embargo, datos positivos de los tres ensayos apoyan identificación de biofilms y establecen protocolos reproducibles para la formación del biofilm inducida por sales biliares.

Protocol

1. preparación de reactivos Medio de las sales biliares: para preparar el caldo de soja tríptica (TSB) que contiene las sales biliares 0,4% (peso/volumen), resuspender 200 mg de las sales biliares en 50 mL esterilizado TSB. Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm. Hacer medio fresco cada semana.Notas: Las sales biliares utilizadas habitualmente es una mezcla de 1:1 de colato sódico y desoxicolato de sodio aislado de las vesículas ovinas y bovinas. Como demostrado anteriormente<sup class="…

Representative Results

En la figura 1, formación de biopelículas se induce en la mayor parte del crecimiento siguiente prueba seis patógenos entéricos en medios que contienen sales biliares. Un aumento significativo de bacterias adherentes después de la exposición de las sales biliares se observa en casi todas las cepas probadas. La excepción es enteroaggregative e. coli (CEEA); sin embargo, tenga en cuenta la observación inducida de los mutantes de la<em…

Discussion

Análisis de la formación de biofilm es un reto debido a la naturaleza dinámica de biofilms y la variabilidad entre cepas, materiales, laboratorios y ensayos. Aquí, se presentan varias estrategias para determinar la formación de biopelículas en patógenos entéricos después de la exposición de las sales biliares con conocimiento experimental para promover la reproducibilidad. Hay consideraciones adicionales para asegurar la reproducibilidad. Ante todo, recomendamos realizar independiente por lo menos tres experime…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Rachael B. Chanin y Alejandro Llanos-Chea para asistencia técnica. Agradecemos a Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski y Bobby Cherayil para las cepas utilizadas en este estudio. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de alergias y K22AI104755 de subvención de enfermedades infecciosas (C.S.F.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Materials

Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich  22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G 
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500 
Formaldehyde Sigma-Aldrich  F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One  655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000
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Referências

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Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).
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