秀丽线虫纵向成像的微流控平台
Summary
在本文中, 我们演示了使用自定义微流控装置的单个蠕虫的实时成像。在该装置中, 多个蠕虫单独局限于单独的分庭, 允许多路纵向监测各种生物过程。
Abstract
在过去十年中, 微流控技术已被应用于研究小动物, 包括线虫秀丽线虫, 并证明是有用的, 作为一个方便的实时成像平台提供能力, 精确控制实验条件的实时性。在本文中, 我们演示了使用 WormSpa, 以前发布的自定义微流控装置的单个蠕虫的实时成像。在该装置中, 多个蠕虫单独局限于单独的分庭, 允许多路纵向监测各种生物过程。为了说明这种能力, 我们进行了实验验证, 其中蠕虫感染了致病细菌, 并连续监测免疫应答基因和产卵的表达动态动物。该设备的简单设计和操作使其适合于以往没有经验的微流控实验的用户。我们建议, 这种方法将是有益的, 许多研究人员感兴趣的纵向观察生物过程在明确的条件下。
Introduction
环境条件的变化可能导致基因程序的激活, 同时诱导和抑制特定基因的表达1,2。这些动态变化可能是不同的组织之间的相同的动物和动物之间。因此, 对这种基因计划的研究要求采用允许对个别动物进行纵向成像的方法, 并提供精确的动态控制环境条件。
近年来, microfabricated 射流装置已被用来研究小动物的反应和行为的许多方面, 包括蠕虫, 苍蝇, 水熊和更多的3,4,5,6, 7。例如, 应用包括深分型、optogenetic 记录神经元活动以响应化学刺激和跟踪马达行为, 如运动和泵浦 8, 9, 10,11。
基于微流控的方法拥有许多性能, 可以帮助对环境线索的长期纵向成像, 包括对局部微环境的精确动态控制, 灵活的设计, 使维护单独的动物在分开的处所和有利属性为成像。然而, 在微流控腔中维持动物很长一段时间, 对他们的良好生命有最小的不利影响是一个挑战, 这需要特别小心的设计, 微流控装置和在执行实验。
在这里, 我们演示了使用 WormSpa, 一个微流控装置的纵向成像的秀丽线虫。5单个蠕虫被限制在腔室中。恒定的低流量的液体和细菌悬浮, 保证蠕虫是良好的喂养和足够活跃, 以保持良好的健康和缓解压力, 和结构的商会允许蠕虫产卵。WormSpa 的设计和操作的简单性应该允许研究人员没有在微流体的经验, 把这一装置纳入他们自己的研究计划。
Protocol
下面的协议使用 WormSpa5, 以前描述的微流控器用于对蠕虫进行纵向成像。WormSpa 的制作 (从 CAD 文件开始, 可以根据要求从作者获得) 是简单的, 但需要一些专门知识。在大多数情况下, 制造可以很容易地由核心设施或提供此类服务的商业公司完成。在制作设备时, 请确保指定特征的高度为50µm。 1. 实验设置 将微流控装置安装在具有机动化阶段的倒置荧光?…
Representative Results
年龄同步的年轻成人蠕虫 (46 小时后 L1 幼虫拘捕在25°c)12已加载到设备中, 如协议中所述。蠕虫单独位于单独的渠道, 使动物对病原体的反应进行纵向测量。当实验成功时, 大多数蠕虫在实验期间仍留在其通道中。在这种情况下, 单个蠕虫的图像只是通过将其通道放置在成像路径中, 从而避免了主动定位该动物的需要。图 2A</strong…
Discussion
微流控工具为研究蠕虫提供了多种好处。与标准的 NGM 琼脂平板相比, 在一台聚甲基硅器件中成像具有更高的成像质量。多个图像可以从一个单一的蠕虫, 与传统的方法, 在这些动物是从板块采摘和安装在显微镜幻灯片的成像。此外, 蠕虫所驻留的微环境可以保持恒定或根据需要进行调制, 允许在环境的构成和动物的反应之间进行精确的映射。
在这里, 我们演示了如何通过一个自…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了国家科学基金会的支持, 通过赠款 PHY-1205494 和 MCB-1413134 (EL) 和韩国国家研究基金会 2017R1D1A1B03035671 (库特勒)。
Materials
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
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Citar este artigo
Lee, K. S., Levine, E. A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (135), e57348, doi:10.3791/57348 (2018).