Uma plataforma Microfluidic para Imaging Longitudinal em Caenorhabditis elegans
Summary
Neste artigo, vamos mostrar imagens ao vivo de vermes individuais empregando um dispositivo microfluidic personalizado. No dispositivo, vários vermes limitam-se individualmente para separar câmaras, permitindo multiplexada vigilância longitudinal de vários processos biológicos.
Abstract
Na última década, microfluidic técnicas foram aplicadas para estudar pequenos animais, incluindo o nematódeo Caenorhabditis elegans, em provaram útil como uma plataforma de imagem ao vivo conveniente, fornecendo recursos para o controle preciso de condições experimentais em tempo real. Neste artigo, vamos mostrar imagens ao vivo de vermes individuais, empregando o WormSpa, um dispositivo microfluidic personalizado anteriormente publicada. No dispositivo, vários vermes limitam-se individualmente para separar câmaras, permitindo multiplexada vigilância longitudinal de vários processos biológicos. Para ilustrar o recurso, realizamos experimentos de prova de princípio em que minhocas foram infectadas no dispositivo com bactérias patogênicas e a dinâmica da expressão de genes de resposta imune e postura de ovos foram monitorada continuamente no indivíduo animais. O design simples e operação deste dispositivo torná-lo adequado para usuários sem experiência anterior com experimentos microfluidic-baseado. Propomos que esta abordagem será útil para muitos pesquisadores interessados nas observações longitudinais de processos biológicos, sob condições bem definidas.
Introduction
Mudanças nas condições ambientais podem levar a ativação de programas genéticos, acompanhado por indução e repressão da expressão de genes específicos1,2. Essas alterações cinéticas podem ser variável entre tecidos nos mesmos animais e entre animais diferentes. Estudos de tais programas genéticos, portanto, chamar para métodos que permitem a imagem longitudinal de animais individuais e fornecem controle dinâmico preciso das condições ambientais.
Nos últimos anos, microfabricated fluídico dispositivos têm sido usados para estudar muitos aspectos da resposta e comportamento em pequenos animais, incluindo vermes, moscas, água ursos e mais3,4,5,6, 7. As aplicações incluem, por exemplo, fenotipagem profunda, optogenetic gravação de atividade neuronal em resposta a estímulos químicos e monitoramento de comportamentos motor, tais como locomoção e bombeamento8,9,10 , 11.
Abordagens baseadas em microfluidic segurar muitas propriedades que poderiam beneficiar a longo prazo de imagem longitudinal da resposta a sinais ambientais, incluindo controle dinâmico preciso do microambiente local, design flexível que permite a manutenção de cada animal em quartos separados e atributos favoráveis para a imagem latente. No entanto, manter animais em uma câmara de microfluidic por um longo tempo com o mínimo impacto adverso sobre seus seres bem é um desafio que requer uma atenção especial no projeto do dispositivo microfluidic, bem como na execução do experimento.
Aqui vamos mostrar o uso de WormSpa, um dispositivo microfluidic para imagem longitudinal de Caenorhabditis elegans. 5 vermes individuais estão confinados em câmaras. Um baixo fluxo constante de suspensão bacteriana e líquido garante que vermes são bem alimentados e suficientemente ativo para manter a boa saúde e aliviar o estresse, e a estrutura das câmaras permite vermes para pôr ovos. A simplicidade do projeto e operação de WormSpa devem permitir que os investigadores com nenhuma experiência anterior em microfluídica para incorporar este dispositivo em seus próprios planos de pesquisa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microfluidic ferramentas fornecem vários benefícios no estudo de vermes. Imaging em um PDMS dispositivo oferece maior qualidade de imagem em comparação com uma placa de ágar padrão NGM. Várias imagens podem ser tomadas a partir de um único verme, em contraste com os métodos tradicionais em que os animais são colhidos a partir da placa e montados sobre uma lâmina de microscópio para a imagem latente. Além disso, o microambiente no qual residem vermes pode ser mantido constante ou modulado conforme desejado, p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pela National Science Foundation através de subvenções PHY-1205494 e MCB-1413134 (EL) e pela 2017R1D1A1B03035671 de concessão da Fundação de pesquisa nacional da Coreia (KSL).
Materials
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
Referências
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
- Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
- Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip – Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- . . NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , (2017).
- Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
- Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
- Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. Regulation of noise in gene expression. Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
- Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).
