En mikroflödessystem plattform för längsgående Imaging i Caenorhabditis elegans
Summary
I denna artikel visar vi live avbildning av enskilda maskar anställa en anpassad mikroflödessystem enhet. I enheten, är flera maskar individuellt begränsade till separata kammare, så att multiplexade längsgående övervakning av olika biologiska processer.
Abstract
Under det senaste decenniet, ultrakalla tekniker har använts för att studera små djur, inklusive Nematoden Caenorhabditis elegans, och har visat sig användbar som en bekväm levande imaging plattform tillhandahåller funktioner för exakt kontroll av experimentella förhållanden i realtid. I denna artikel visar vi live avbildning av enskilda maskar anställa WormSpa, en tidigare publicerade anpassade mikroflödessystem enhet. I enheten, är flera maskar individuellt begränsade till separata kammare, så att multiplexade längsgående övervakning av olika biologiska processer. För att illustrera förmåga, utförde vi ett proof-of-principle experiment där maskar smittades i enheten med patogena bakterier och dynamiken i uttryck av immunsvar gener och äggläggning övervakades kontinuerligt i enskilda djur. Enkel konstruktion och drift av denna enhet gör den lämplig för användare utan tidigare erfarenhet med mikroflödessystem-baserade experiment. Vi föreslår att detta tillvägagångssätt blir användbar för många forskares longitudinella observationer av biologiska processer under väl definierade förhållanden.
Introduction
Förändringar i miljöförhållanden kan leda till aktivering av genetiska program åtföljs av induktion och förtryck av uttrycket av specifika gener1,2. Dessa kinetiska förändringar kan vara variabel bland vävnader i samma djur och mellan olika djur. Studier av sådana genetiska program efterlyser därför metoder som längsgående avbildning av enskilda djur och ge exakt dynamiska kontroll av miljöförhållanden.
Under de senaste åren har biochips fluidic enheter använts för att studera många aspekter av svar och beteende i små djur, inklusive maskar, flugor, vatten björnar och mer3,4,5,6, 7. Tillämpningar inkluderar, till exempel djup fenotypning, optogenetic inspelning av neuronal aktivitet som svar på kemiska stimuli, och spårning av motor beteenden såsom förflyttning och pumpa8,9,10 , 11.
Mikroflödessystem tillvägagångssätt håller många egenskaper som skulle kunna gynna långsiktiga längsgående avbildning av svar på miljömässiga ledtrådar, inklusive dynamiska precisionskontroll av den lokala mikromiljö, flexibel konstruktion som möjliggör underhåll av enskilda djur i separata håll och gynnsamma attribut för avbildning. Att upprätthålla djur i en mikroflödessystem kammare under en lång tid med minsta möjliga negativa påverkan på deras väl varelser är dock en utmaning, som kräver särskild omsorg i utformningen av mikrofabricerade enheten samt i utförandet av experimentet.
Här visar vi användningen av WormSpa, en mikroflödessystem enhet för längsgående avbildning av Caenorhabditis elegans. 5 enskilda maskar är begränsade i kamrarna. En konstant lågt flöde av vätska och bakteriell suspension garanterar att maskar är välnärda och tillräckligt aktiv för att upprätthålla god hälsa och lindra stress, och strukturera av kamrarna gör maskar att lägga ägg. Enkelheten i utformningen och driften av WormSpa bör tillåta forskare utan tidigare erfarenhet i mikrofluidik att införliva denna enhet i sina egna forskningsplaner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroflödessystem verktyg ger flera fördelar i att studera maskar. Imaging i en PDMS erbjuder enheten högre imaging kvalitet jämfört med en standard NGM agarplatta. Flera bilder kan tas från en enda mask, i motsats till traditionella metoder där djur är plockade från plattan och monterade på ett objektglas för avbildning. I närmiljön där maskar bosatta kan dessutom hållas konstant eller modulerad som önskat, tillåter exakt mappning mellan sammansättningen av miljön och djuren respons.
<p class="jov…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av National Science Foundation genom bidrag PHY-1205494 och MCB-1413134 (EL) och av den National Research Foundation of Korea grant 2017R1D1A1B03035671 (KSL).
Materials
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
Referências
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
- Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
- Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip – Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- . . NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , (2017).
- Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
- Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
- Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. Regulation of noise in gene expression. Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
- Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).
