Summary

Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones

Published: June 29, 2018
doi:

Summary

Describimos el uso de optogenetics y grabaciones electrofisiológicas para la manipulación selectiva de oscilaciones de hippocampal de la theta (5-10 Hz) en ratones de comportarse. La eficacia del arrastre de ritmo se controla usando el potencial de campo local. Una combinación de opto – e inhibición farmacogenética aborda la lectura eferente del hipocampo sincronización.

Abstract

Datos extensos sobre las relaciones de las oscilaciones de la red de los nervios al comportamiento y organización de descarga neuronal en regiones cerebrales convocatoria de nuevas herramientas manipular selectivamente ritmos cerebrales. Aquí se describe un enfoque que combina proyección específica optogenetics con electrofisiología extracelular para alta fidelidad control de oscilaciones de hippocampal de la theta (5-10 Hz) en ratones comportarse. La especificidad de la optogenetic de arrastre se logra apuntando channelrhodopsin-2 (ChR2) a la población de GABAérgico de células septales mediales, crucialmente implicadas en la generación de oscilaciones de la theta del hipocampo, y un local sincronizado activación de un subconjunto de los aferentes septales inhibitorios en el hipocampo. La eficacia del control de ritmo optogenetic es verificada por un seguimiento simultáneo del local campo potencial (LFP) a través de la lámina de la zona CA1 y de la descarga neuronal. Utilizando esta preparación fácilmente implementable muestran eficacia de diferentes protocolos de estimulación optogenetic para la inducción de las oscilaciones de la theta y la manipulación de la frecuencia y regularidad. Por último, una combinación del control de ritmo theta con la inhibición específica de proyección aborda la lectura de determinados aspectos de la sincronización hipocampo regiones eferentes.

Introduction

La actividad neuronal en los mamíferos es coordinada por las oscilaciones de la red, que ayudan a la transferencia de información dentro y entre el cerebro regiones1,2,3,4. Ritmos cerebrales son oscilaciones que van desde muy lento ( 200 Hz) frecuencias. Un cuerpo grande de evidencia apoya participación de oscilaciones de la red en las funciones cerebrales diversas, incluyendo la cognición5,6,7,8,9,10 , comportamientos naturales11,12 , así como trastornos neuropsiquiátricos como la enfermedad de Parkinson y epilepsia13,14,15. Selectivos y temporal precisos métodos para la manipulación experimental de las oscilaciones de la red por lo tanto son esenciales para el desarrollo de modelos fisiológicamente plausibles de la sincronización y para establecer relaciones causales con el comportamiento.

Sincronización de red está mediada por procesos, que van desde la identidad molecular de los canales iónicos y su cinética de neuromodulación de la excitabilidad y conectividad de red y diversos substratos biológicos. El diseño biológico de ritmo generadores16 ha sido revelado por muchos aspectos distintos (p. ej., frecuencia, amplitud), ritmos cerebrales son a menudo provocada por la dinámica de redes y tipos de células distintas. Por ejemplo, interneuronas inhibitorias dirigidas a los Somas de las células principales son los jugadores más importantes a través de las bandas de frecuencia y cerebro regiones17,18, incluyendo theta19,20, gamma20 , 21y22 oscilaciones de ondulación (140-200 Hz). A su vez, sincronización de la fase de células distantes es asegurada por robusto feed-forward de señalización de las células piramidales, que restablece la leña de interneuronas. Un parámetro fundamental de oscilaciones, el tamaño de la población neuronal sincronizada, está estrechamente relacionada con la amplitud de la oscilación medida de LFP y, al menos para las oscilaciones rápidas, depende de la unidad excitadora sobre interneuronas2. Por el contrario, las oscilaciones más lentas, como ritmos de la theta y delta son generadas por largo alcance bucles reentrantes, formados por cortico-talámico23,24 y proyecciones septal medial hipocampo25, 26,27, respectivamente. Oscilaciones en dichos circuitos son generadas por interacciones de retardos de propagación de señal, excitables respuestas y sus preferencias de frecuencia en células participantes de28,29,30, 31 , 32. proyecciones inhibitorias de GABAérgico parvalbúmina (PV)-células del septo medial (MS) a interneuronas en el hipocampo25,33, regiones de parahippocampal y entorhinal cortex26 son positivas esencial para la generación de oscilaciones de la theta en el lóbulo temporal medial. Así, los mecanismos fisiológicos de las oscilaciones de la red y sincronización neuronal pueden ser manipulados usando optogenetics con una precisión en tiempo real.

Manipulaciones de células optogenetic tipo-específicas se han aplicado para estudios de oscilaciones corticales y hippocampal en vitro34,35,36,37,38 y en vivo30,39,40,41,42,43,44,45, incluyendo funcional las investigaciones de gamma5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52 y ondulación oscilaciones40,53,54 y sueño husos55,56. Recientemente, expresamos un virus dependiente de la Cre ChR2 en la MS, una región clave para la generación del ritmo hippocampal de la theta, de ratones PV-Cre. Con esta preparación, características de las oscilaciones theta hippocampal (frecuencia y estabilidad temporal) fueron controlados por el estímulo optogenetic de proyecciones inhibitorias de la MS en el hipocampo11. Además, estimulación de frecuencia theta optogenetic de proyecciones FCSP-hippocampal inhibitorias evoca ritmo theta durante inmovilidad despierto. La optogenetically arrastrado ritmo theta muestran propiedades de oscilaciones theta espontánea en el ratón en la LFP y los niveles de actividad neuronal.

Características principales de este protocolo son: (1) utilización de una vía inhibitoria que es fisiológicamente importante para oscilaciones theta espontánea evitando efectos inespecíficos en la excitabilidad del hipocampo; (2) axonal, es decir, estímulo específico de proyección para minimizar una influencia directa sobre no hippocampal MS eferentes; (3) local theta rítmica estimulación de luz, asegurando una mínima interferencia directa con theta rítmica dinámica FCSP-hipocampo y un arrastre global bilateral de las oscilaciones theta; (4) paramétrico control de frecuencia de las oscilaciones theta y regularidad; y (5) cuantificación de fidelidad de arrastre con alta resolución temporal con la LFP para permitir análisis de causalidad cuantitativa en comportamiento de animales. Ya que esta preparación esencialmente capitaliza un papel bien conocido de la FCSP-hippocampal desinhibición en theta generación25,30, permite control robusto sobre varios parámetros de las oscilaciones de la theta en comportarse ratones. Estudios donde menos investigados caminos y tipos de la célula de la circuitería de FCSP-hipocampo fueron manipulan38,39,47,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 además revelar mecanismos del ritmo theta.

Protocol

PV-Cre knock-en ratones machos59, 10-25 semanas de edad, fueron utilizados. Ratones fueron alojados bajo condiciones estándar en las instalaciones de animales y mantenidos en un ciclo de 12 h luz/oscuridad. Todos los procedimientos fueron realizados con arreglo a directrices nacionales e internacionales y fueron aprobados por las autoridades sanitarias locales (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen). 1. viral inyección Duran…

Representative Results

Orientación de ChR2 células GABAérgicas en el MS como se describe en la sección 1 se ilustra en la figura 2A. Optogenetic estimulación de los axones de células GABAérgicas MS en el hipocampo dorsal a través de una fibra óptica que se implanta encima de la zona CA1 arrastra las oscilaciones de la theta en la frecuencia del estímulo en el ipsilateral (figura 2B) y contralateral Hemisferio (figura 2</s…

Discussion

Aquí presentamos una metodología ampliamente accesible para arrastrar y provocar oscilaciones de la theta del hipocampo en el comportamiento animal. Este enfoque puede ser útil para estudios de funciones de ritmo theta en procesamiento de la información y el comportamiento. Aspectos críticos de este método incluyen: (1) elección de la opsina y el señalamiento de ChR2 en axones de MS de las células en el hipocampo, características ópticas y eléctricas (2) robustas de asambleas de matriz implantado hilos de fib…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a Maria Gorbati experto ayuda con análisis de datos y Jennifer Kupferman para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; NeuroCure EXC 257, TK y AP; Programa prioritario 1665, 1799/1-1(2), programa de Heisenberg, 1799/2-1, AP), la Fundación israelo-alemana para la investigación científica y desarrollo (GIF; I-1326-421.13/2015, TK) y el programa de ciencia de frontera humana (HFSP; RGY0076/2012, TK).

Materials

PV-Cre mice The Jackson Laboratory B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotaxis David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA Model 963 Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument
Drill bits, 0.8 mm Bijoutil, Allschwil, Switzerland 49080HM
0.01-1 ml syringe Braun, Melsungen, Germany 9161406V
Sterican cannulas Braun 26 G, 0.45×25 mm BL/LB
Fine and sharp scissors Fine Science Tools Inc., Vancouver, Canada 14060-09
Forceps Fine Science Tools Inc. 11210-10 Dumont AA – Epoxy Coated Forceps
Blunt stainless steel scissors Fine Science Tools Inc. 14018-14
Soldering station Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany WSD 81
Erythromycin Rotexmedica GmbH, Trittau, Germany PZN: 10823932 1g Powder for Solution for Infusion
Name Company Catalog Number Comments
Optogenetics
Hamilton pump PHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA model 703008 PHD Ultra Syringe Pump with push/pull mechanism
Hamilton 5 µL Syringe, 26 gauge PHD Ultra, Harvard Apparatus Model 75 RN SYR
Hamilton 5 µL Plunger PHD Ultra, Harvard Apparatus Model 75 RN SYR
Tubing Fisher Scientific, Pittsburgh, USA PE 20 Inner diameter 0.38 mm (.015"), Outer diameter 1.09 mm (.043")
Sterican cannulas Braun, Melsungen, Germany 27 G, 25×0.40 mm, blunt
Precision drill/grinder Proxxon, Wecker, Luxemburg fbs 240/e
Cutting disks Proxxon NO 28812
Cre dependent channelrhodopsin Penn Vector Core, Philadelphia, PA, USA AV-1-18917P Contruct name: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, titer: 1.42×1013 vg/ml
Cam kinase dependent halorhodopsin Penn Vector Core AV-1-26971P Construct name: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, titer: 2.08_1012 vg/ml
Multimode optic fiber ThorLabs, Dachau, Germany FG105LCA 0.22 NA, Low-OH, Ø105 µm Core, 400 – 2400 nm
Ceramic stick ferrule Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA CFLC126 Ceramic LC MM Ferrule, ID 126um
Polishing paper Thorlabs LF3D 6" x 6" Diamond Lapping (Polishing) Sheet
Power meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD
Multimode fiber optic coupler Thorlabs FCMM50-50A-FC 1×2 MM Coupler, 50:50 Split Ratio, 50 µm GI Fibers, FC/PC
Fiberoptic patch cord Thorlabs FG105LCA CUSTOM-MUC custom made, 3 m long, with protective tubing, Tubing: FT030, Connector 1: FC/PC, Connector 2: 1.25mm (LC) Ceramic Ferrule
Sleeve Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA ADAL1 Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25 mm (LC/PC) Ferrules
473 nm DPSS laser Laserglow Technologies, Toronto, ON, Canada R471005FX LRS-0473 Series
593 nm DPSS laser Laserglow Technologies R591005FX LRS-0594 Series
MC_Stimulus II Multichannel Systems, Reutlingen, Germany STG 4004
Impedance conditioning module Neural microTargeting worldwide, Bowdoin, USA ICM
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology
Tungsten wires California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USA CFW0010954 40 µm, 99.95%
Capillary tubing Optronics 1068150020 ID: 100.4 µm
Omnetics nanoconnector Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, USA A79038-001
Screws Bilaney, Düsseldorf, Germany 00-96×1/16 stainless-steel
Silicone probe NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USA B32
Headstage Neuralynx, Bozeman, Montana USA HS-8 miniature headstage unity gain preamplifiers
Silver conductive paint Conrad electronics, Germany 530042
Liquid flux Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Germany Lötöl ST DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)
LED Neuralynx HS-LED-Red-omni-10V
Name Company Catalog Number Comments
Software
MATLAB Mathworks, Natick, MA, USA
MC_Stimulus software Multichannel, Systems
Neurophysiological Data Manager NDManager, http://neurosuite.sourceforge.net
Klusters http://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006
Software of the recording system Neuralynx Cheetah https://neuralynx.com/software/cheetah
Multi-channel data analysis software Cambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GB Spike2

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Citar este artigo
Bender, F., Korotkova, T., Ponomarenko, A. Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice. J. Vis. Exp. (136), e57349, doi:10.3791/57349 (2018).

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