昆虫の精母細胞の染色体の顕微操作

Summary

このプロトコルの選択とそれらの細胞内の染色体の位置を変更するマイクロマニピュレーション用の適切なセルの作製と圧電マイクロマニピュレーターの使用をについて説明します。

Abstract

マイクロマニピュレーション染色体の染色体の整列を進める、紡錘体チェックポイントおよび後期染色体の動きのメカニズムを照らすための重要な方法をされているし、何が染色体の動きをコントロールを理解する鍵となっています細胞分裂。熟練した生物学者は、スピンドル、細胞内の染色体の位置を変更し、染色体の小さなガラス針を用いた非常に細かいチップに力を加えるから染色体をデタッチするのにマイクロマニピュレーターを使用できます。摂動は、光圧など他の方法およびレーザーの他の用途を使用して染色体を行うことができます、まで、他の方法許可されません数十から数百ミクロンの細胞への損傷なしには少し規模の細胞成分の再配置.

選択とキリギリスとコオロギの精母細胞の初代培養の住セルイメージ投射とマイクロマニピュレーションで使用するための準備を具体的に解説した染色体の顕微操作の適切なセルの準備です。ここで説明しました。さらに、分裂細胞内の染色体の位置を変更するそれに取り付けられたガラス針でセル、およびジョイスティック制御の圧電マイクロマニピュレーターの使用内の染色体の移動に使用する針の構造を示します。サンプルの結果は、一次精母細胞のスピンドルから染色体を切断し、細胞内染色体を再配置するマイクロマニピュレーターの使用を示します。

Introduction

マイクロマニピュレーション、染色体の整列を進める、紡錘体チェックポイントおよび後期染色体の動きのメカニズムの部分を明らかにしました。マイクロマニピュレーション実験の結果を説明する最も早い文書はロバート ・ チェンバース¹だった。チャンバーは、プローブ数が異なる種類の細胞の細胞質に添付のガラスの針式マイクロマニピュレーターを使用しました。残念ながら、部屋の実験は、このような細胞成分を再配置の効果を表示できませんでしたので当時、利用できません染色体と細胞内の多くの他の細胞成分の可視化を許可するコントラスト メソッドがでした。染色体位置を変更初期のマイクロマニピュレーション スピンドル midzone 後期の細胞でこのような操作が後期バッタ神経^{2 染色体腕の位置を変えることができることを示すを掃引するのにチャンバー装置を使用}.ニクラスと彼の共同研究された最初の染色体の良いマイクロマニピュレーションを実行する染色体³をストレッチ、スピンドルからそれらをデタッチおよび向きかえ^3,4、安定化を誘導します。malorientation 染色体^5,6,7に張力を適用すると、後期^8,9のスピンドルによって生成される力を測定します。ニクラス ラボ、他の作品は、細胞質の顆粒には操作¹⁰可能性があり、マイクロマニピュレーション¹¹によって中心を再配置できることを示した。マイクロマニピュレーションは染色体とその他の細胞の部品を移動するためだけに有用ではありません。マイクロマニピュレーション針は鞭毛細胞¹²の紡錘をきれいに切ることができるまたは核膜¹³を溶解する使用ことができます。さらに、隣接するセルはマイクロマニピュレーション^14,15融合することができます。

ことができる興味深い実験のような多種多様なマイクロマニピュレーションを使用すると、それ意外では一見マイクロマニピュレーション実験が非常にいくつかの染色体生物学者によって行われていること。この欠乏の理由の一つは、脊椎動物の組織から派生して、染色体の動きを研究するために使われる有糸分裂分割培養細胞は micromanipulate に非常に困難なことです。これらの培養細胞一般に針””目視の取得方法で、染色体に針が到達できないか、針は細胞壁の破壊、死につながる、セルを磨く皮質細胞骨格があります。我々 は、マイクロマニピュレーションを使用している他の実験者は、マイクロマニピュレーションをしやすくする節足動物細胞を発見しました。節足動物精母細胞ハロカーボン油の層の下に簡単に広がっているし、はるかに少ない堅牢な皮質細胞骨格細胞膜細胞分裂の間に基になるに表示されます。したがって、節足動物の精巣を提供 meiotically 分割細胞 (精母細胞) の良い情報源、マイクロマニピュレーションを容易にアクセス可能な染色体を持つ細胞 (精原細胞) の有糸分裂分割します。針がない細胞膜を浸透明らかに操作中に固定バッタ状態のシリアルセクショニング細胞膜は、(個人的なコミュニケーション ニクラス r. b.) の指針に変形します。昆虫とクモの分類群の数から精母細胞はバッタ、祈るカマキリ、ショウジョウバエ、ガガンボ、コオロギ、spittlebugs、蛾、ブラック未亡人のスパイダー、セラーのスパイダー、オーブ編むくも^{を含む micromanipulated を正常にされています。3,7,17,18,19,20,21,22}。昆虫から培養、有糸分裂分割セルは、micromanipulated をすることができます。たとえば、初代培養でバッタを神経芽細胞の染色体は、micromanipulated^2,23を容易にすることができます染色体を持ちます。利用可能な培養ショウジョウバエ由来株とその他の昆虫が、micromanipulatable になりますが我々 はこれらの細胞の手法をテストしていない疑いがあります。バッタやコオロギから細胞分裂を準備するマイクロマニピュレーション用ことができますどのように我々 が表示されます。コオロギは、年の任意の時間でほとんどのペット店から入手しやすい。研究者研究室コロニーにアクセスできますが、使用される種 (飼 sanguinipes)、セル、および長い、操作が簡単な染色体に簡単に平坦化された場合を除き、バッタ、夏に簡単に得られるのみです。

なぜマイクロマニピュレーション実験は生物学者のほんの一握りで行われているもう一つの理由は、市場で、染色体をも移動マニピュレーターがまれに利用できることです。ジョイスティック制御の圧電マイクロマニピュレーター制御振動、ドリフトやジョイスティックの動きと針の動きのずれと針の動きが、他の種類のマニピュレーターも正常に染色体をプッシュすることが、我々 は発見しました。周辺セルで。エリスと Begg^25,26によって設計されたマニピュレーターは、古い技術を使用して、彼らが染色体の顕微操作に最適です。圧電式のマイクロマニピュレーターは、現在入手可能な一般的に使用される電気生理学;しかし、これらのマニピュレーターは、通常のジョイスティック制御ではありません。ジョイスティック コントロールが成功したマイクロマニピュレーションに必要な滑らかな動きにキーとジョイスティックのユーザー設定、構築して染色体の顕微操作のために働く現在利用可能な圧電式のマイクロマニピュレーターをするので。最高動作するジョイスティック制御の圧電マニピュレーターがある直接位置制御、ジョイスティックの動きを針の動きに直接変換します。

簡単に置き換えることができます市販パーツといくつかの小さな 3次元印刷コンポーネントから新しく設計された圧電マイクロマニピュレーターを構築でき、染色体マイクロマニピュレーション²⁴適しています。マニピュレーターは調節可能な感度、手動粗位置決めと振動、ドリフト、または針の動きや針の直接位置決め制御の遅れ。科学者は、命令の利用可能なオンライン²⁴を用いたマイクロマニピュレーターを構築できます。以下は一次精母細胞の細胞培養の準備し、micromanipulating のメソッドをその文化の細胞内の染色体。

Protocol

1. マイクロマニピュレーション用主な昆虫の精母細胞の細胞培養の準備 スライドの準備 スライドの中心をカット 20 mm 径の円孔を有する 75 mm × 25 mm のガラス スライドを取得します。注: これらは中央の穴とスライド グラスのサイズにウィンドウ ガラスの単一のシートから切られました。 2 ブンゼン バーナーの炎の中に 25 mm × 25 mm #1.5 coverslip を実行 s。 スラ…

Representative Results

図 6は、マイクロマニピュレーションの用途のいくつかの例では 2 の隣接するバッタ一次精母細胞のサンプル マイクロマニピュレーションを示します。この実験が行われた、倒立位相差顕微鏡を使用しています。0:00 (示されている時刻は、min:s にある) イメージ操作する前に両方のセルが表示されます。マイクロマニピュレーション針によって?…

Discussion

練習では、細胞での染色体の移動は、第二の天性になることができます。」のコツを取得”を十分に硬いと十分に薄い先端針しにくい加工しますが、この能力も実際に付属して。ハロカーボン油で移動すると変形の様子が結構、針は細胞の染色体を押すために便利されません。ヒントが表示され、染色体の幅の 1/3 くらい (またはそれ以上) は細胞を殺すために非常に可能性が高いので針を鈍ら…

Materials

VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25×25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order–call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300