Micromanipulación de los cromosomas de espermatocitos de insectos
Summary
En este protocolo, se describen la selección y preparación de células apropiadas para la micromanipulación y el uso de un micromanipulador piezoeléctrico para volver a colocar los cromosomas dentro de las células.
Abstract
Ha sido un método esencial para iluminar el mecanismo para cromosoma congression, el puesto de control de huso y los movimientos de cromosoma anafase la micromanipulación de los cromosomas y ha sido clave para entender lo que controla movimientos del cromosoma durante División de célula. Un biólogo experto puede utilizar un micromanipulador para separar los cromosomas del eje, para volver a colocar los cromosomas dentro de la célula y para aplicar fuerzas a los cromosomas con una aguja de pequeño de vidrio con una punta muy fina. Mientras que las perturbaciones se pueden hacer a los cromosomas utilizando otros métodos como las trampas ópticas y otros usos de un láser, hasta la fecha, ningún otro método permite la reposición de componentes celulares en la escala de decenas a cientos de micras con poco a ningún daño a la célula .
La selección y preparación de las células apropiadas para la micromanipulación de los cromosomas, específicamente describiendo la preparación de saltamontes y grillo espermatocito primario para el uso en proyección de imagen de células vivas y micromanipulación, son se describe aquí. Además, mostramos la construcción de una aguja para utilizarse para mover los cromosomas en la célula y el uso de un micromanipulador piezoeléctrico controlado por joystick con una aguja de vidrio para reposicionar los cromosomas dentro de las células divisorias. Un resultado de ejemplo muestra el uso de un micromanipulador para separar un cromosoma de un eje en un espermatocito primario y para volver a colocar ese cromosoma dentro de la célula.
Introduction
Micromanipulación ha revelado las partes del mecanismo para un cromosoma congression, puesto de control de eje y movimientos de cromosoma anafase. La primera publicación que describe los resultados de experimentos de micromanipulación era por Robert Chambers1. Cámaras utilizan un micromanipulador mecánica con una aguja de vidrio adjunta para sondear el citoplasma de un número de diferentes tipos de células. Por desgracia, métodos de contraste que permitieron la visualización de los cromosomas y de muchos otros componentes celulares en las células vivas no estaban disponibles en el momento, para que experimentos de cámaras no pueden mostrar los efectos de reubicar estos componentes celulares. Principios micromanipulations que alteración la posición del cromosoma el aparato de cámaras usado para barrer el midzone del huso en células de la anafase, mostrando que tales manipulaciones podrían alterar la posición de los brazos del cromosoma en neuroblastos de saltamontes de anafase2 . Nicklas y sus colaboradores fueron los primeros en realizar finos micromanipulations de cromosomas, estirando los cromosomas3, separarlas del husillo e induciendo una reorientación3,4, estabilizar una malorientation aplicación de tensión a los cromosomas5,6,7, y midiendo las fuerzas producidas por ejes en anafase8,9. Otro trabajo en el laboratorio de Nicklas demostró que los gránulos citoplásmicos también podrían ser manipulado10 y que los centrosomas podrían cambiarse por micromanipulación11. Micromanipulación no es sólo útil para mover los cromosomas y otros componentes celulares. Una aguja de micromanipulación puede cortar limpiamente a través de un huso mitótico en las células de demembranated12 o se puede utilizar para disolver el sobre nuclear13. Además, se pueden fusionar células adyacentes por micromanipulación14,15.
Con una amplia variedad de experimentos interesantes que pueden hacerse mediante micromanipulación, sorprende a primera vista que se han realizado experimentos de micromanipulación por muy pocos biólogos de cromosoma. Una de las razones para esta deficiencia es que las células cultivadas se dividen mitotically que se derivan de los tejidos vertebrados y se utilizan para estudiar los movimientos del cromosoma son extremadamente difíciles de micromanipulate. Estas células de cultivo de tejidos en general tienen un citoesqueleto cortical que “se pone en el camino” de la micromanipulación de la aguja y los cromosomas ya no se puede llegar por la aguja o muele la aguja a través de la célula, conduciendo a una ruptura de la célula y la muerte. Nos y otros experimentadores que usan micromanipulación, hemos encontrado células artrópodas para ser susceptibles de micromanipulación. Espermatocitos de artrópodos se extienden fácilmente bajo una capa de aceite de halocarburos y parecen tener un mucho menos robusto citoesqueleto cortical subyacente a la membrana de la célula durante la división celular. Así, los testículos artrópodos proporcionan una buena fuente de células dividirse meiotically (espermatocitos) y mitotically dividirse las células (espermatogonios) con cromosomas fácilmente accesibles para la micromanipulación. Un seccionamiento serial de un espermatocito de saltamontes fijado durante una manipulación reveló que la aguja no penetra la membrana de la célula; la membrana de la célula se deforma alrededor de la aguja (Nicklas R.B., comunicación personal). Espermatocitos de un número de taxones de insectos y arañas han estado micromanipulated con éxito, incluyendo saltamontes, orando Mantis, moscas de la fruta, moscas grúa, grillos, spittlebugs, polillas, arañas viuda negra, arañas del sótano y las arañas orbe-que teje 3,7,17,18,19,20,21,22. Las células cultivadas, mitotically dividirse de insectos pueden ser micromanipulated. Por ejemplo, los cromosomas en neuroblastos saltamontes en un cultivo primario tienen cromosomas que pueden ser fácilmente micromanipulated2,23. Sospechamos que el cultivado líneas derivadas de Drosophila y otros insectos también se micromanipulatable, aunque no hemos probado la técnica con estas células. Vamos a mostrar cómo dividir celdas de saltamontes y grillos se puede preparar para una micromanipulación. Grillos son fáciles de obtener de la mayoría de las tiendas para mascotas en cualquier momento del año. Saltamontes son fácilmente obtenibles en el verano a menos que el investigador tiene acceso a una colonia de laboratorio, pero la especie utilizada (Melanoplus sanguinipes) ha aplanado fácilmente las células y los cromosomas largos, fácil de manipular.
Otra razón por qué se han realizado experimentos de micromanipulación por un puñado de biólogos es que micromanipuladores que mueven los cromosomas bien están raramente disponibles en el mercado. Hemos encontrado que un micromanipulador piezoeléctrico controlado por joystick controla el movimiento de la aguja sin vibración, deriva o desfase entre el movimiento de la palanca de mando y el movimiento de la aguja, pero otros tipos de manipuladores con éxito pueden empujar los cromosomas alrededor de la célula. Los micromanipuladores diseñados por Ellis y Begg25,26 son ideales para la micromanipulación de los cromosomas, aunque utilizan tecnología más antigua. Micromanipuladores piezoeléctricos están actualmente disponibles y utilizados en electrofisiología; sin embargo, estos micromanipuladores no son normalmente controlado por joystick. Control de joystick es clave para los movimientos requeridos para un exitoso micromanipulación, y un joystick personalizado debe ser construido de tal manera para trabajar los micromanipuladores piezoeléctricos actualmente disponibles para una micromanipulación de cromosoma. Los micromanipuladores piezoeléctricos controlado por joystick que mejor funcionan tienen control directo de posición, en que el movimiento de la palanca de mando se traduce directamente en un movimiento de la aguja.
Un micromanipulador piezoeléctrico nuevo diseño puede construirse de piezas comercialmente disponibles que pueden ser reemplazados fácilmente y de algunos pequeños componentes impresos 3D, y funciona bien para cromosoma micromanipulación24. El micromanipulador sensibilidad ajustable, posicionamiento manual gruesa y no tiene vibración, deriva o retraso en el movimiento de la aguja y el control directo de la posición de la aguja. Los científicos pueden construir el instrumental quirúrgico con instrucciones disponibles en línea24. A continuación se presentan los métodos para la preparación de un cultivo celular de espermatocito primario y micromanipulating los cromosomas dentro de las células en esa cultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la práctica, moviendo los cromosomas en la célula puede convertirse en segunda naturaleza. Agujas que son lo suficientemente rígidos y suficientemente delgada con punta son difíciles “conseguir la habilidad de” fabricación, pero esta capacidad también viene con la práctica. Las agujas que son tan finas que se deforman cuando se movió en el aceite de halocarburos no será útiles para empujar los cromosomas en la célula. Las agujas que son tan embotan que sus consejos son visibles y tan grandes como 1/3 de la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias por su valiosa discusión Jessica Hall.
Materials
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25×25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order–call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
Referências
- Chambers, R. Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon. Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).
- Carlson, J. G. Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata. Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).
- Nicklas, R. B., Staehly, C. A. Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle. Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).
- Nicklas, R. B. Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis. Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes. Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).
- Nicklas, R. B., Ward, S. C. Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension. Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Nicklas, R. B. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).
- Nicklas, R. B. The forces that move chromosomes in mitosis. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis. Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells. Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).
- Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules. Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).
- Nicklas, R. B. Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes. Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).
- Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm. Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).
- Forer, A., Koch, C. Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes. Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).
- Camenzind, R., Nicklas, R. B. The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis. Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).
- Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae). Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).
- Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius. Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).
- Golding, A. E., Paliulis, L. V. Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution. PLoS One. 6, e24748 (2011).
- Doan, R. N., Paliulis, L. V. Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer). Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension. Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).
- . . Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , (2018).
- Ellis, G. W. Piezoelectric micromanipulators. Science. 138 (3537), 84-91 (1962).
- Ellis, G. W., Begg, D. A., Zimmerman , . A. M., Forer, A. Chromosome micromanipulation studies. Mitosis/Cytokinesis. , 155-179 (1981).
- Powell, E. O. A microforge attachment for the biological microscope. Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).
- Alsop, G. B., Zhang, D. Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Anaphase’ and cytokinesis in the absence of chromosomes. Nature. 382, 466-468 (1996).
