Summary

高通量三维肿瘤球体药物筛选的生成

Published: September 05, 2018
doi:

Summary

在各种疾病征兆中, 越来越多的生理相关模型被开发并实施到药物发现计划中。这里描述的新的模型系统展示了三维肿瘤球体如何在高通量1536井板系统中进行培养和筛选, 以寻找新的肿瘤药物。

Abstract

癌细胞通常在塑料表面的两个维度 (2D) 培养。然而, 这种技术缺乏肿瘤肿块在体内暴露的真实环境。实体肿瘤生长不像附着在塑料上的一张纸, 而是作为一个三维 (3D) 空间中的克隆细胞的集合, 与邻居相互作用, 并具有不同的空间特性, 如正常细胞极性的破坏。这些相互作用导致 3 d-培养细胞获得形态学和细胞特征, 这是更相关的体内肿瘤。此外, 肿瘤肿块与其他细胞类型 (如基质和免疫细胞) 直接接触, 以及其他所有细胞类型的细胞外基质。沉积的基质由大分子如胶原蛋白和纤连蛋白组成。

为了增加从长凳到床边的肿瘤学研究结果的翻译, 许多团体开始研究3D 模型系统在药物开发策略中的应用。这些系统被认为在生理上是相关的, 因为它们试图重述肿瘤的复杂和异构环境。然而, 这些系统可能相当复杂, 尽管可以在96井格式中增长, 而有些现在甚至在 384, 但它们对于大规模的增长和筛选提供了很少的选择。这一观察到的差距导致了这里详细描述的方法的发展, 以培养肿瘤球体在高吞吐量能力在 1536年-井板。这些方法是对高度复杂的基于矩阵的系统的一种折衷, 它们很难筛选, 而且是常规的2D 检测。各种癌细胞系窝藏不同的基因突变被成功筛选, 检查复合功效通过使用一个精心策划的化合物库, 针对丝裂原活化蛋白激酶或 MAPK 通路。然后将球状培养反应与2D 生长的细胞反应进行比较, 并报告差异活动。这些方法为在高通量3D 设置中测试复合活动提供了唯一的协议。

Introduction

在过去的十年中, 越来越多的研究已经实施了3D 细胞培养模型, 以了解不完全概括的概念, 在2D 的塑料上生长的细胞。这些概念的例子包括正常上皮细胞极性1的交替, 在那里细胞的顶端和基底层的空间方向丢失, 以及细胞外基质在调节生存和细胞命运方面的作用。特别是肿瘤学研究已经使用3D 模型来了解癌细胞的基本生物学和2D 和3D 细胞培养系统之间的差异3,4。更复杂的细胞培养技术的发展以及它们对多井格式的进一步适应使得在3D 环境中寻找新药。与2D 条件下生长的细胞相比, 3D 模型的肿瘤范围复杂, 从分层细胞系统5到单细胞型球体不同大小, 到复杂的多细胞型球体6,7,8. 因此, 发现完全诱导这些3D 模型系统中的细胞死亡的新型化合物或生物制品, 对药物发展运动有很大的兴趣。这些化验的终点通常与在2D 文化中进行的实验的端点相同, 以评估细胞增殖的变化, 但是当在生理上相关的环境中进行时, 它们可能揭示目标基因或通路的真正依赖性水平。审问。

如上所述, 已经开发了各种模型系统来研究3D 培养系统中的药物反应, 但是大多数使用96或384井微量滴定板, 并且不容易适应经常使用的高通量筛选 (高温超导) 格式。药物发现筛选运动。这类系统包括使用悬浮液滴技术、球形培养、带磁性微粒的脉动细胞来诱导漂浮, 以及含有天然或合成凝胶的培养物, 如胶原蛋白、胶或聚乙二醇 (PEG)2.在这里, 我们提出了一个以前开发的技术的详细方法, 以生产3D 球状文化从已建立的癌细胞系1536井板格式。在本协议中, 使用高度定义的介质来防止附着正常附着的细胞线9。这个系统有局限性 (也就是说, 它不能完全重述一个复杂的癌症模型系统), 但尽管如此, 这些化验能够对大量小分子集合进行高通量筛选, 并对药物反应进行横向比较。在2D 和3D 之间的文化对各种细胞系和化合物。

所选的细胞系用于演示本文中的方法, 所有与 MAPK 信号通路相关的基因的海港突变, 一种在癌症中高度失调的通路, 并且有许多疗法可用。许多线有激活致癌突变在柯尔多大鼠肉瘤病毒也称为 KRAS, 神经母细胞瘤 RAS 或 NRAS, 哈维大鼠肉瘤病毒癌基因或 HRAS, 和相关的激酶迅速加速纤维肉瘤, 也称为RAFs。最近的文献表明, 在3D 条件9,10的情况下, 这种通路的不同节点抑制剂在细胞系的子集中具有独特的功效。一项研究发现, 当有活性 RAS 的癌细胞在3D 培养时, 它们显示出对 MAPK 抑制剂的敏感性增强, 而且这种方法可以识别传统2D 中可能遗漏的通路和靶向抑制剂。设置。本研究的目的是介绍用于培养这些细胞系的方法, 并进一步证明对这些抑制剂的差异反应, 只有在使用3D 细胞培养系统时才能观察到。

Protocol

1. 1536年井3D 肿瘤球体的培养 将以下试剂加入500毫升的 Dulbecco 修饰鹰培养基 (DMEM/F12) 中, 制备新鲜的3D 肿瘤球形培养基茎 (细胞培养基 + 挖空血清置换 + 胰岛素-转铁蛋白-硒): 1x 青霉素/链霉素, 10 人/毫升碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF), 20 ng/毫升人表皮生长因子 (EGF), 0.4% 牛血清白蛋白 (BSA), 1x 胰岛素-转铁蛋白-硒, 1% 挖空 (高) 血清置换 (不冻融)。 过滤-通过0.4 µm 瓶顶过滤系统的补充剂?…

Representative Results

在2D 的培养条件下, 各种已知生长良好的癌细胞系使用此处概述的方法进行了测试。图 1中有来自各种 MAPK 突变癌细胞系 (Calu-6:KRAS、NCI-H1299:NRAS、SK-MEL-30:NRAS 和 KNS-62:HRAS) 的代表性图像。这些图像表明, 虽然细胞系有不同的形貌, 每一个形成了3D 结构在1536井的化验板块。图 2表明, 当用于大规模筛选时, 可以观察2D 和3D 之间的差异?…

Discussion

本文介绍了如何在1536年的大型复合筛板上生产肿瘤球体的详细协议。这些方法最初是根据国家癌症研究所的工作改编的, 那里的肿瘤球体生长在6井和96井板块的低吞吐量化验中, 询问有关遗传依赖性和复合敏感性13的问题,14,15. 本议定书的一个关键和独特的特点是, 球体是由传统的2D 组织培养的细胞组成的 1536年-板块使用定义的?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者希望在国家促进转化科学中心 (国家卫生研究院) 上承认他对这些化验的初步发展的支持和指导。此外, 我们要感谢艾莉弗里曼, Mariela Jaskelioff, 迈克尔 Acker, 雅各 Haling, Vesselina 库克作为项目团队成员的科学投入和讨论。

Materials

Reagents
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 ATCC 30-2006 Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Lonza 12-604F Purchased as a prepared solution.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Lonza 12-115Q Purchased as a prepared solution.
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-500 Purchased as a prepared solution.
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Hyclone SH30042.01 Purchased as a prepared solution.
1x Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 Purchased as a prepared solution.
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) Sigma F0291 Resuspend in sterile water.
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644 Resuspend in sterile water.
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9418 Resuspend in sterile PBS and filter.
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) Gibco 51500056
1% KnockOut (KO) Serum Replacement Gibco 10828-028 Add fresh right before use.
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma 276855-100ML
CellTiter-Glo Promega G7573 Purchased as a prepared solution.
Consumables
Small Combi Cassette ThermoFisher 24073295
Small Multiflow Cassette BioTek 294085
1536-well sterile TC plates (white) Corning 3727
1536-well sterile TC plates (black) Corning 3893
Scivax Plates MBL International NCP-LH384-10
Equipment
Adhesives seals ThermoFisher AB0718
Spinning Incubator LiCONiC
Stainless Steel Lids The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Acoustic Dispensor EDS Biosystems
Echo Acoustic Dispensor Labcyte
Luminometer Envision-Perkin Elmer
Peristaltic Pump- Multidrop Combi ThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FX BioTek

Referências

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Citar este artigo
Griner, L. M., Gampa, K., Do, T., Nguyen, H., Farley, D., Hogan, C. J., Auld, D. S., Silver, S. J. Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening. J. Vis. Exp. (139), e57476, doi:10.3791/57476 (2018).

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