Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas
Summary
Uma grande variedade de indicações de doença, modelos mais fisiologicamente relevantes estão sendo programas de descoberta de drogas desenvolvida e implementada em. O novo sistema de modelo aqui descrito demonstra como tridimensional tumor esferoides podem ser cultivadas e exibidos em um sistema de baseado em placa de 1536-bem elevado-throughput para pesquisar novas drogas de Oncologia.
Abstract
As células cancerosas rotineiramente têm sido cultivadas em duas dimensões (2D) em uma superfície de plástico. Esta técnica, no entanto, carece o verdadeiro ambiente um tumor massa é exposta ao vivo em. Tumores sólidos crescem não como uma folha anexada ao plástico, mas em vez disso como uma coleção de células clonais em um tridimensional (3D) espaço interagindo com seus vizinhos e com distintas Propriedades espaciais tais como o rompimento da polaridade celular normal. Essas interações causam células 3D-cultivadas para adquirir características morfológicas e celulares que são mais relevantes para tumores na vivo . Além disso, um tumor em massa está em contato direto com outros tipos de células, como células do estroma e imunes, bem como de todos os outros tipos de células, a matriz extracelular. A matriz depositada é composta de macromoléculas como o colágeno e fibronectina.
Na tentativa de aumentar a tradução dos resultados da investigação em oncologia do banco ao lado da cama, muitos grupos começaram a investigar o uso de sistemas de modelo 3D em suas estratégias de desenvolvimento de drogas. Estes sistemas são pensados para ser mais fisiologicamente relevantes porque eles tentam recapitular o ambiente heterogêneo e complexo de um tumor. Estes sistemas, no entanto, podem ser bastante complexos, e, embora passível de crescimento em formatos de 96 poços e alguns agora mesmo em 384, oferecem poucas opções para o crescimento em grande escala e triagem. Este observado lacuna levou ao desenvolvimento dos métodos aqui descritos pormenorizadamente esferoides de tumor de cultura em uma capacidade de alta produtividade em placas de 1536-bem. Esses métodos representam um compromisso aos sistemas baseados na matriz altamente complexos, que são difíceis de tela e ensaios 2D convencionais. Uma variedade de linhas de células de câncer abrigando diferentes mutações genéticas são rastreados com êxito, examinando a eficácia do composto usando uma biblioteca com curadoria de compostos visando o caminho Mitogen-Activated proteína quinase ou MAPK. As respostas de cultura esferoide são então comparadas com a resposta das células cultivadas em 2D, e diferenciais atividades são relatadas. Esses métodos fornecem um protocolo exclusivo para testes de atividade composta num ambiente 3D de alto rendimento.
Introduction
Na última década, cada vez mais estudos têm implementado o uso de modelos de cultura celular 3D para entender conceitos que não são totalmente instaurados pelo crescimento de células em 2D em plástico. Exemplos desses conceitos incluem as alternâncias na célula epitelial normal polaridade1 onde a orientação espacial das camadas basais e apicais das células são perdidos, bem como o papel da matriz extracelular na regulação da sobrevivência e destino da célula. Pesquisa de Oncologia, em particular, tem usado modelos 3D para entender a biologia básica das células cancerosas e as diferenças entre 2D e 3D celular cultura sistemas3,4. O desenvolvimento de técnicas mais sofisticadas de cultura celular e sua adaptação adicional para formatos múltiplos bem permitiu a busca de novas drogas nas configurações 3D. Em contraste com células cultivadas sob condições 2D, modelos 3D de variedade de tumores em complexidade de sistemas celulares em camadas5 single-célula do tipo esferas de tamanhos diferentes, para o complexo de multi-cell-tipo de esferas6,7, 8. a descoberta de novos compostos ou produtos biológicos que induzem a morte celular potente nestes sistemas modelo 3D é, portanto, de grande interesse nas campanhas de desenvolvimento de drogas. Pontos de extremidade destes ensaios muitas vezes são idênticos às realizadas em culturas 2D para avaliar alterações na proliferação celular, mas quando realizado em uma configuração mais fisiologicamente relevante, eles podem revelar o verdadeiro nível de dependência do gene alvo ou caminho sendo interrogado.
Como apresentado acima, uma variedade de sistemas modelo foram desenvolvidos para estudar respostas de drogas nos sistemas de cultura 3D, mas a maioria usa ou placas de microtitulação de 96 ou 384-bem e não é facilmente adaptável para os formatos de elevado-throughput screening (HTS) geralmente usados em campanhas de rastreio droga descoberta. Tais sistemas incluem o uso de tecnologias da gota, culturas de esferoide, células com partículas magnéticas para induzir a levitação, culturas e incorporando géis naturais ou sintéticas, como o colágeno, Matrigel ou polietileno glicol (PEG)2 a pulsar de suspensão . Aqui, apresentamos os métodos detalhados de uma técnica previamente desenvolvido para produzir culturas 3D esferoide de linhas de células de câncer estabelecido em um formato de placa 1536. Neste protocolo, um meio altamente definido é usado que impede a fixação de linhas de células normalmente aderentes9. Este sistema tem limitações (ou seja, é totalmente não pode recapitular um sistema complexo modelo de câncer), mas, no entanto, estes ensaios permitem uma seleção de alto rendimento de grandes coleções de pequenas moléculas e comparações transversalmente da resposta da droga entre 2D e 3D culturas contra uma variedade de linhas de células e compostos.
As linhas de células selecionado para demonstrar os métodos neste artigo todos harbor mutações em genes relacionados com a MAPK, sinalizando o caminho, um caminho que é altamente prejudicado em câncer, e para que muitos terapêutica estão disponíveis. Muitas das linhas tem ativação oncogênicas mutações no vírus Kirsten Rat Sarcoma também conhecido como KRAS, o RAS Neuroblastoma ou ARN, do oncogene do vírus Harvey Rat Sarcoma ou HRAS e os associado quinases Fibrosarcomas rapidamente acelerado, também conhecido como Bruno. Literatura recente sugere que os inibidores de diferentes nós deste percurso são excepcionalmente mais eficazes em um subconjunto das linhas celulares quando cultivadas sob condições 3D9,10. Um estudo descobriu que quando as células cancerosas com RAS ativo foram cultivadas em 3D, eles demonstraram uma sensibilidade aumentada aos inibidores de MAPK e ainda mais, que esta abordagem poderia identificar caminhos e alvo inibidores que podem ser perdidos em 2D tradicional configuração. O objetivo deste estudo é apresentar os métodos de cultura destas linhas de celular, e ainda mais, para demonstrar o diferencial de respostas para estes inibidores que podem ser observadas somente quando estiver usando 3D célula sistemas de cultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos apresentados aqui demonstram um protocolo detalhado sobre como produzir esferoides de tumor em placas de 1536-bem para as sessões de composto em grande escala. Esses métodos foram inicialmente adaptados do trabalho no Instituto Nacional de câncer onde esferoides de tumor foram cultivadas em ensaios de baixa produtividade em placas 6-poços e 96 poços para fazer perguntas sobre genéticas dependências e sensibilidade composto13, 14 , <s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores que gostaria de agradecer Marc Ferrer no centro nacional por avançando Ciências translacionais, institutos nacionais de saúde para seu apoio e orientação sobre o desenvolvimento inicial destes ensaios. Além disso, gostaríamos de agradecer a Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling e Vesselina Cooke para sua entrada científica e discussão como membros da equipe do projeto.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
Referências
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