Выступ силовой микроскопии: Метод количественного определения сил, разработанный ячейки выступов
Summary
Здесь мы подробно экспериментальные методы, используемые для оценки силы выступа, которые podosomes применить на совместимый фильм, от подготовки фильма для автоматизированного анализа топографических изображений.
Abstract
В многочисленных биологических контекстах животных клеток необходимо физически взаимодействовать с окружающей их средой путем разработки механических сил. Среди них тяговой силы были хорошо изученных, но существует нехватка технологий, позволяя измерения силы выступ, оказываемое клетки ортогонально к их основанию. Мы разработали экспериментальной установки для измерения силы выступ, оказываемое адэрентных клеток на их поверхности. Клетки, покрытие на листе совместимый Formvar деформируют этот субстрат и результате топографии сопоставляется с атомно-силовой микроскопии (АСМ) в нанометровом масштабе. Затем значения извлекаются из анализ деформации профиля на основе геометрии выступающем клеточных структур. Таким образом силы, оказываемое отдельных выступающих единиц живой клетки может быть измерена с течением времени. Этот метод даст возможность изучения формирования сил и его регулирования во многих клеточных процессах, связанных с выступа. Здесь мы описываем его применение для измерения выступающем силы, порожденные podosomes, образованного человека макрофагов.
Introduction
Животных клеток физически взаимодействовать с матрицы и другие клетки, которые составляют их окружающей среды1. Это требуется для их переноса, усваивать органы, приобретать внешней информации или дифференцировать. В таких процессах, ячейка должна генерировать механических сил и, как показывают многочисленные исследования за последние годы, способность ячейки для создания сил и зонд окружающей среды влияет на его биологического поведения, например направляя распространения или дифференциация2,3. В свою очередь измерение сотовой сил является основной помощи изучить правила формирования сил и понять ее последствия в клетки тканей и поведение судьба4,5.
Последние годы стали свидетелями многочисленных методов для измерения силы, которые ячейки может оказать на ее окружающей среде6. Большинство из них играют важную роль в раскрытии что тяговых сил, что клетки оказывают как они тянут на мобильных зондов или деформируемые субстрата. Однако механических сил, участвующих в выступ в внеклеточной окружающую среду страдают от отсутствия методов измерения и являются на сегодняшний день не характерны.
Чтобы преодолеть это ограничение, мы представляем метод измерения силы оказываемого ортогонально к подложке. Он состоит в покрытие живых клеток на листе тонкой упругой, могут деформироваться в ортогональных направлении, что делает его возможным для измерения деформации подложки клеток и вывести силы, участвующие. Субстрат топографии измеряется с наночастицами резолюции с помощью атомно-силовой микроскопии и оценки сил от деформации опирается на знание геометрии выступающем клеточных структур7,8, 9.
Здесь мы описываем установку и его применение для измерения силы, порожденные podosomes, выступающем адгезии структуры, образованные макрофаги их мезенхимальных миграции в трехмерных средах10,11, 12,13,14,,1516,17. Мы считаем, что этот метод будет заранее понимание формирования сил и его регулирования во многих клеточных процессах, связанных с выступа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Свойства материала
Выбор материала для деформируемых мембраны, в нашем случае Formvar, необходимо выполнить несколько требований. Материал должен быть прозрачным для видимого света и выставку ограниченное auto флуоресценции позволяющие наблюдений в светлые област…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны Анна Labernadie, Гийом Шарьер и Патрик Delobelle за их первоначальный вклад в эту работу и Matthieu Санчес и Франсуаза Viala за их помощь с видео съемки и редактирования. Эта работа была поддержана l’Agence Nationale de la исследований (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche сообщала (FRM DEQ2016 0334894), INSERM план рака, рака Тулуза Fondation и человека пограничной науки программы (RGP0035/2016).
Materials
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
Referências
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Gilbert, P. M., Weaver, V. M. Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying Forces in Cell Biology. Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).
- Labernadie, A., et al. Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes. Nature Communications. 5, 5343 (2014).
- Proag, A., et al. Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors. ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).
- Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking. Methods. 94, 75-84 (2016).
- Cougoule, C., et al. Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis. Blood. 115, 1444-1452 (2010).
- Cougoule, C., et al. Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments. European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).
- Guiet, R., et al. Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A. Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).
- Maridonneau-Parini, I. Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration. Immunology Review. 262, 216-231 (2014).
- Park, H., et al. Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function. Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).
- Van Goethem, E., et al. Macrophage Podosomes Go 3d. European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).
- Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures. Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).
- Verollet, C., et al. Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages. Blood. 125, 1611-1622 (2015).
- Bouissou, A., et al. Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring. ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).
- Lizarraga, F., et al. Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells. Pesquisa do Câncer. 69, 2792-2800 (2009).
- Carman, C. V., et al. Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes. Immunity. 26, 784-797 (2007).
- Sage, P. T., et al. Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells. Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).
- Sens, K. L., et al. An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion. Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).
- Takito, J., et al. The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts. Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).
- Shilagardi, K., et al. Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion. Science. 340, 359-363 (2013).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
