Summary
מיקרוגלייה הם תאים חיסוניים המוח כי סקר ולהגיב המוח שינו פיסיולוגיה באמצעות שינויים מורפולוגיות אשר עשויים להעריך באופן כמותי. זה מתאר פרוטוקול ImageJ מבוסס פרוטוקול ניתוח כדי לייצג מיקרוגלייה מורפולוגיה רציפה לנתונים על פי מדדים כגון הסתעפויות תא, המורכבות צורה.
Abstract
מיקרוגלייה הם phagocytes המוח להשתתף המוח הומאוסטזיס, סקר ללא הרף סביבתם בתפקוד, פגיעה של המחלה. כמו המגיבים הראשונים, מיקרוגלייה יש תפקידים חשובים כדי להמתיק בתפקוד הנוירון, עכשיו, דונלד, בתהליך זה, הם עוברים מגוון רחב של שינויים מורפולוגיות. מיקרוגלייה מורפולוגיות יכולים להיות מסווגים descriptively או, לחלופין, ניתן לכמת כמשתנה רציף עבור פרמטרים כגון הסתעפויות תא, המורכבות צורה. בעוד שיטות לכימות מיקרוגלייה מוחלים על תאים בודדים, כמה טכניקות חלות מיקרוגלייה מרובים ב- photomicrograph כולו. מטרת שיטה זו היא לכמת מרובות, תאים בודדים באמצעות פרוטוקולי ImageJ זמינים. פרוטוקול זה הוא סיכום של הפעולות ImageJ תוספים מומלץ להמיר photomicrographs פלורסצנטיות, בהיר-שדה להחליפן בתמונות בינאריות, skeletonized, לנתח אותם באמצעות תוספים התוכנה AnalyzeSkeleton (דו-ממדי/תלת-ממדי) ו- FracLac עבור איסוף נתונים מורפולוגיה. התוצרים של התוספים האלה לסכם תא מורפולוגיה מבחינת תהליך נקודות קצה, צמתים, ואת אורך וכן המורכבות, תא צורה, גודל מתארי. פרוטוקול ניתוח שלד המתוארים בזאת היא מתאימה עבור ניתוח האזורי של מיקרוגלייה מרובות בתוך כל photomicrograph או אזור בעל עניין (ROI) בעוד FracLac מספק ניתוח משלימים תא בודד. הפרוטוקול משולב, מספק של המטרה, כלי להערכת רגיש, ומקיף זה יכול לשמש כדי stratify בין מיקרוגלייה מגוונות מורפולוגיות במוח נפגע ובריאה.
Introduction
מיקרוגלייה יש מענה מיידי ומגוון מורפולוגיות כדי שינויים במוח פיזיולוגיה1 לאורך רצף של אפשרויות שנעים בטווח שבין מורפולוגיות hyper-השלכה ומורכבים מאוד ל מורפולוגיות כחוד דה, amoeboid2 . מיקרוגלייה עלול גם להיות מקוטב ו מוט בצורת3. מיקרוגלייה תא הסתעפויות מוגדר בדרך כלל כ צורה מורכבת שיש תהליכים מרובים, לעיתים קרובות המדווח מספר נקודות קצה עבור כל תא והאורך של תהליכים בתא. מאז מיקרוגלייה מכוילים לפונקציה עצביים, גליה עד תא רציפה-תא צולבות לדבר, אין ויוו תנועתיות4,5, מורפולוגיות מיקרוגלייה עשוי לשמש אינדיקטורים של פונקציות מגוונות תא בתפקוד במוח. בגישה הכמותית יש צורך מילים שיכולות לתאר את הגיוון של שינויים אלה מורפולוגיות, כדי להבחין את ההבדלים בין תאים כחוד להתרחש עם לפליטת הפיזיולוגיות עדין (כגון אפילפסיה5,6 זעזוע מוח7) בנוסף לפגיעה ברוטו (כגון קו8). שימוש מוגבר מורפולוגיה כימות7,8,9,10,11,12,13,14 תחשוף את המגוון המלא של מורפולוגיות מיקרוגלייה בזמן מחלה ובריאות. ההווה ללמוד פרטים השימוש stepwise ImageJ תוספים הדרושים לסכם מיקרוגלייה מורפולוגיה של photomicrographs פלורסנט או פלורסנט שאינן של מיקרוגלייה רכשה ברקמת מכרסמים קבוע לאחר אימונוהיסטוכימיה (IHC).
המרכזית של טכניקות ניתוח המתוארים כאן הם ImageJ תוספים AnalyzeSkeleton (דו-ממדי/תלת-ממדי)15, שפותחה בשנת 2010 כדי לכמת את החלב מבנים גדולים, ו FracLac16, שפותחה בשנת 2014 לשלב ImageJ וניתוח פרקטל כדי לכמת צורות מיקרוגלייה בודדים. תוספים אלה מספקים ניתוח מהיר של הסתעפויות מיקרוגלייה בתוך כל photomicrographs או מיקרוגלייה מרובים של רועי מוגדר בתוך photomicrograph. ניתוח זה עשוי לשמש לבד או משלים עם ניתוח פרקטל. הניתוח פרקטל תא בודד (FracLac) דורש השקעה של זמן, אבל מספק במספר יציאות מורפולוגיה בנוגע מיקרוגלייה המורכבות, צורה וגודל. השימוש בשני כלים הוא לא יתיר, כתא הסתעפויות משלים תא המורכבות, השילוב של פרמטרים מרובים עשוי לשמש כדי להבחין בין מורפולוגיות מיקרוגלייה מגוונות בתוך datasets12,17.
Protocol
כל הניסויים שאושרו על-ידי וביצע בהתאם להנחיות שנקבעו על-ידי אוניברסיטת אריזונה. טיפול בבעלי חיים מוסדיים ואת הוועדה להשתמש NIH הנחיות טיפול ושימוש חיות מעבדה. הוקדשה כדי למזער את חיה בכאב ואי נוחות. שיטות המתת חסד הם על פי פרוטוקול שאושר, מורכב עריפת ראש צוואר הרחם תחת הרדמה איזופלוריין.
1. רקמות הכנה
הערה: לבצע ניתוח מורפולוגיה מיקרוגלייה על דגימות רקמה cryoprotected קבוע, כדי לשמר את התא מורפולוגיה. לפניכם פרוטוקול רגיל להכין ולקבל ישירות לחתוך רקמות קבוע עבור קרינה פלואורסצנטית IHC.
- הסר את המוח עכבר או חולדה חיה לאללה לאחר הניסוי הרצויה ועל פי פרוטוקול סטנדרטי מעבדה. למקם את המוח לתוך בקבוקון 10 מ"ל המכיל 5 מ של פתרון paraformaldehyde 4% עבור 24 שעות-4 מעלות צלזיוס. ואז לשטוף ואת המקום אל תוך 5-10 מ"ל פוספטים 30% סוכרוז buffered פתרון (PBS, 0.01 M) 72 h-4 מעלות צלזיוס. לאחסן כל המוח ב- 80 ° C עד רקמות חלוקתה עם cryostat או ב 4 ° C אם חלוקתה עם מיקרוטום.
הערה: פרוטוקול זה לא כבר נבדקו באמצעות רקמות פרוסים מרקמות פרפין-מוטבע. - סעיף רקמת המוח עובי המקטע הרצוי, התמצאות באמצעות סעיפים לתרשים או cryostat או מיקרוטום בעלת החנות בפתרון cryoprotection (50 מ"מ ל- PBS, אתילן גליקול, גליצרול) ב-20 ° C.
הערה: פרוטוקול זה בהצלחה התבצע על מקטעי רקמת הילתית החל מיקרומטר 50 מיקרומטר 200 עובי. רקמות סעיפים פחות מאשר 50 מיקרומטר עשוי ללכוד את טווח מלא של תהליכים מיקרוגלייה, בסעיפים רקמות עבות, IHC מכתים עשוי להיות לא מושלם עקב נוגדנים חדירה לתוך רקמות. רקמות יכול להיות הכיוון משרטוטי גם ב הפרונטליים או הווריד, בחירה זו תהיה תלויה region(s) המטרה והמוח ניסיוני שילמדו.
2. אימונוהיסטוכימיה
הערה: ניתן להחיל שלד ושיטות ניתוח פרקטל זריחה או 3, 3′-diaminobenzidine (DAB) IHC. להלן פרוטוקול IHC קרינה פלואורסצנטית רגילה, יכול להיות מוחלף בהתאם לצורך. קרינה פלואורסצנטית IHC התשואות סופריור ויזואליזציה של תהליכי התא בהשוואה IHC כי אמחה קלות.
- במקום הסעיפים רקמה לתוך בקבוקון זכוכית 4 מ"ל (עד 15 העכבר מוח מקטעים/מבחנה), דגירה עם 1 מ"ל של פתרון המכיל עד כדי 10% הסוס סרום, PBS (0.01 M), 0.5% טריטון, נאן 0.04%3 בטמפרטורת החדר (23 ° C) לשעה.
- רחץ במשך חמש דקות עם PBS (0.01 M) שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
- דגירה עם נוגדן ראשוני (Iba1, 1:1, 000) בטמפרטורת החדר במשך 72 h ב- 1 מ"ל של פתרון המכיל PBS (0.01 M), 0.5% טריטון, נאן 0.04%3, ומקורה (כדי לשמר את האפקטיביות3 נאן).
- רחץ במשך חמש דקות עם PBS (0.01 M) שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
- דגירה עם הנוגדן המשני (אנטי-ארנב 488, 1:250) מכוסה בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות ב- 1 מ"ל של לאודנום PBS (0.01 M), 0.5% טריטון, נאן 0.04%3
- רחץ במשך חמש דקות עם PBS (0.01 M) שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
- הר הסעיפים רקמת המוח (מספר וכיוון בהתבסס על העדפות) על השקופיות לספסל, להחיל בינוני רך-ערכת הרכבה על השקופית, הצב את coverslip על הרקמה. לאחסן את השקופיות ב 4 º C.
הערה: עובי זכוכית 1.5 coverslip נדרש עבור הדמיה קונפוקלי. רך-set הוא מדיום הרכבה מועדף בגלל צמיגות גבוהה לא לדחוס את הרקמה ושומרת הטוב המורפולוגיה בהשוואה הרכבה hard-set מדיה.
3. הדמיה
- תמונה Iba1 תאים חיוביים במקטע רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או קונאפוקלית זה יש יכולת רכישת z-מחסנית באמצעות 20 X אובייקטיבית אחת או יותר.
הערה: הדמיה פרמטרים ולהגדרה תוכנה צריכה להיות קבועה עבור כל רכישה photomicrograph בניסוי. פירוט תהליך מעולה מתקבל באמצעות 40 X או המטרה X 63. זה אפשרי ליישם את הפרוטוקול ניתוח שלד המתוארים בזאת photomicrograph כולו או של רועי מרובת-תאים בתוך photomicrograph גדול.- לרכוש תמונות 8 סיביות על-ידי שימוש בהגדרות התוכנה המתאימה ספציפי על התוכנה מיקרוסקופ.
הערה: ההמרה של קבצים ל- 8 סיביות שלאחר הרכישה שעלולה לעוות את איסוף הנתונים. - לרכוש לפחות 30 מיקרומטר z-מחסנית עם לא יותר מרווח 2 מיקרומטר בין תמונות באמצעות הגדרות תוכנה מתאימה ספציפית לתוכנה מיקרוסקופ.
הערה: המיקרוסקופ והתוכנה צריך לאפשר ייבוא תמונות בציר X, Y ו- Z. Z-מחסנית ניתן להגדיל, מרווח הזמן עשוי להיות ירד כדי לספק פרטים נוספים מיקרוגלייה. בתמורה, הדמיה זמן יגדל. השתמש הדגימה של נייקוויסט במידת האפשר עבור קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.
- לרכוש תמונות 8 סיביות על-ידי שימוש בהגדרות התוכנה המתאימה ספציפי על התוכנה מיקרוסקופ.
- לשמור את כל הקבצים כקבצי Tif או כנדרש על-ידי התוכנה מיקרוסקופ.
- לפתוח את קבצי Tif ב- ImageJ, להשתמש בסרגל הכלים כדי לפצל ערוצים על ידי לחיצה תמונה | צבע | פצל ערוצים, מחסנית תמונות על ידי לחיצה תמונה | ערימות | X פרוייקט | הטלה בעוצמה מקסימלית במידת הצורך. לשמור כקבצי. tif.
4. שלד ניתוח
- להוריד פיג'י או ImageJ מ < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. להורדה תוספים בודדים, AnalyzeSkeleton(2D/3D) מ- < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>15 ולהוריד FracLac מ < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>16.
הערה: תהליך המרה של photomicrograph ל- skeletonized תמונה בינארית לוקח פחות מ- 1 דקות. - אם משתמש photomicrograph על-ידי קרינה פלואורסצנטית, להבטיח שכשהתמונה היא של 8 סיביות ולהמיר לגווני בצורה הטובה ביותר להמחיש מכתים כל חיובי. השתמש בסרגל הכלים, לחץ על תמונה | טבלאות בדיקת מידע | אפורים. אם משתמש של DAB המוארים-שדה צילום, שימוש ראשון bandpass FFT לסנן תוסף (באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תהליך | FFT | מסנן bandpass) ולאחר מכן להמיר לגווני אפור.
הערה: לצורך של פרוטוקול זה, ImageJ הגדרות ברירת המחדל מסנן Bandpass FFT הן מספיקות (מסנן עד 3 פיקסלים, ל-40, אין דיכוי פס). החלת מסנן FFT Bandpass הסרת רעש (תכונות קטנות) תוך שמירה על ההיבטים גדול הכולל של התמונה. פעולה זו יעילה במיוחד בתמונות שדה בהיר, שבו מתפצל סדקים ברקמת יכול להופיע בתור רקע, ובכך לסבך את הניתוח שלד18. - להתאים את הבהירות והניגודיות אם התמונה מעומעם מדי, לא ניתן לאבחן את התהליך מיקרוגלייה. השתמש בסרגל הכלים, לחץ על תמונה | התאם | בהירות/חדות. התאם את המחוונים המינימלי או המקסימלי לפי הצורך, עד הקצוות של ההיסטוגרמה אבל לא יותר.
הערה: ב- ImageJ, הבהירות והניגודיות מוחלפים על-ידי עדכון טבלת בדיקת מידע של התמונה (LUT), אז ערכי הפיקסלים אינן משתנות. מחווני Max ו- min לשלוט לגבולות העליון והתחתון של הטווח התצוגה, עם ערכי הפיקסלים מעל 255 המופיעים לבן וערכי פיקסלים מתחת ל-0 המופיעים שחור18. במקרה של זריחה photomicrographs, המחוון המירבי אמור לשמש, ואילו המחוון המינימלי ישמש עבור photomicrographs של DAB צבעונית מיקרוגלייה. - הפעל במסנן ' הסר חידוד מסיכה ' להמשיך להגדיל את החדות בעזרת הכלים על ידי לחיצה תהליך | מסננים | הסר חידוד מסיכה. למטרות של פרוטוקול זה, הגדרות ברירת המחדל של ImageJ (רדיוס הפיקסל של 3 וליצירת מסיכה המשקל של 0.6) משמשים.
הערה: חידוד מסיכה מחדד ומגבירה את התכונות קצוות של תמונה על-ידי הפחתה גרסה מטושטשת של התמונה (המסכה חידוד) מן המקור ולאחר מכן מיזוג התמונה שתיווצר עם גירסת ניגודיות גבוהה של התמונה המקורית. לכן, המסנן ' הסר חידוד מסיכה ' אינו יוצר פרטים, אך מעדיפה מבהיר את הפירוט הקיימים בתמונה. רדיוס שינויים בהגדרות איך מטושטשת על חידוד מסיכה יהיה (, ובכך לטשטש כמה יוסרו), ואת המשקל מסכת שינויים בהגדרות מידת הניגודיות זה הסר חידוד מסיכה ימוזגו עם (ומתאים ובכך את החדות של התמונה הסופית). - לבצע צעד despeckle כדי להסיר מלח ופלפל רעש שנוצר על ידי חידוד מסיכה. השתמש בסרגל הכלים, לחץ על תהליך | רעש | הסרת לכלוכים.
הערה: הפחתת כתמים הסרת רעש מלח ופלפל על-ידי החלפת כל פיקסל עם הערך החציוני בשכונה 3 × 3 שלה. התוצאה היא כי ליניאריים בעוצמתם מוחלפים הפיקסל החציוני מבלי להשפיע על החדות של קצוות18. - המירו את התמונה למצב בינארית באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תמונה | התאם | סף.
הערה: קביעת סף stratifies את התמונות בגווני אפור אל תכונות עניין לעומת הרקע, ממירה את התמונה הבינארית18. - להחיל את despeckle, קרוב-, ולהסיר ליניאריים פונקציות: בתמונה בינארי וכתוצאה מכך, ייתכנו רעשי הרקע פיקסל יחיד ואת הפערים בין תהליכים.
- להחיל את הפונקציה despeckle באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תהליך | רעש | הסרת לכלוכים.
הערה: החלת לנקות כתמים קבצים בינאריים התמונה מסיר כל רעש פיקסל יחיד הנותרים. - להחיל את הפונקציה קרוב באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תהליך | בינארית | קרוב.
הערה: תוסף זה מחבר שני פיקסלים כהים אם הם מופרדים על-ידי עד 2 פיקסלים. - להחיל את הפונקציה ליניאריים הסרה באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תהליך | רעש | הסר ליניאריים.
הערה: לצורך של פרוטוקול זה, בהיר ליניאריים מיועדים עם רדיוס הפיקסל של 2, סף של 50. תוסף זה מחליף פיקסל בהיר או כהה חריג חשוד טעות על ידי הפיקסלים החציוני באזור שמסביב אם זה בכשליש יותר מסוים ערך (הסף)18.
- להחיל את הפונקציה despeckle באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תהליך | רעש | הסרת לכלוכים.
- לשמור את התמונה כקובץ נפרד עבור ניתוח שימוש ו/או פרקטל בעתיד, skeletonize את התמונה באמצעות הכלים על ידי לחיצה תהליך | בינארית | Skeletonize.
- בחר את התמונה skeletonized ולהפעיל את התוסף AnalyzeSkeleton(2D/3D) באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תוספים | שלד | לנתח את השלד, ובדיקת תיבת מידע אודות הסניף.
הערה: סביר כי עיבוד התמונה ידרוש אופטימיזציה עם הוספה או מחיקה של הצעת שלעיל. בתהליך זה, תמונות skeletonized העריכו דיוק על-ידי יצירת כיסוי של השלד של התמונה המקורית. Somas צריך להיות מקור יחיד נקודות עם תהליכים שמקורם במרכז; somas מעגלית לבלבל את הנתונים, יש להימנע באמצעות פרוטוקול ההתאמה. דוגמה של נקודת מוצא יחיד לעומת somas מעגלית מודגם באיור1.
בעיות נפוצות וכתוצאה מכך בלתי מייצג שלדים והציע פתרונות:
- התמונה עמום מדי: להמיר בגווני אפור, להתאים את המחוונים ' בהירות/ניגוד ', ו/או להחיל חידוד מסיכה
- יותר מדי רקע: להתאים את המחוונים ' בהירות/ניגוד ', החל Despeckle, ו/או להסיר ליניאריים
- Somas מעגלית בתמונת skeletonized (במיוחד עבור תמונות קרינה פלואורסצנטית): להחיל מסנן FFT Bandpass, ו/או חידוד מסיכה
- סדקים ברקמת (במיוחד עבור תמונות בהיר-שדה): החלת המסנן FFT Bandpass, ו/או הפחתת כתמים
- להעתיק את כל הנתונים מן התוצאות וכן מידע סניף פלטי להדביק את הנתונים בתוך גיליון אלקטרוני של Excel.
- ב- Excel, לקצץ את הנתונים כדי להסיר חלקי השלד הנובעות IHC ורכישת תמונות.
- שכפל את חוברת העבודה ניסוי עם פלט הנתונים הגולמיים מניתוח שלד ולהוסיף לקצץ שם הקובץ. כל הנתונים הבאים זמירה צריך להתרחש בחוברת המשוכפלת כדי לשמר את הנתונים הגולמיים לשימוש עתידי ללא הפניה.
- לקבוע איזה אורך של קטעים להיות מעוטרים מ ערכת הנתונים על-ידי פתיחת התמונה skeletonized ImageJ ובחירת הכלי קו. למדוד את מספר שברים, לוקח את הפתק של האורך הממוצע, ולהחליט על ערך סף.
הערה: לצורך של הנתונים שהוצגו כאן, אורך חיתוך עבור חלקים לא רצויים הוא 0.5. ערך זה צריך להיות עקבי לאורך כל dataset. - מותאם אישית למיין את הגיליון האלקטרוני Excel על-ידי לחיצה על מיון וסינון | מיון מותאם אישית. מיין לפי "קצה voxels" מהגדולה לקטנה, רמה חדשה, על ידי "Mx סניף pt" מהגדולה לקטנה.
- להסיר כל שורה המכילה 2 נקודות קצה באורך הענף מרבית של פחות ערך הסף (כלומר., 0.5). לסכם את הנתונים בעמודה נקודות קצה כדי לחשב את המספר הכולל של נקודות קצה שנאספו מתוך התמונה.
- חזור על ענף מידע נתונים: מיין לפי 'סניף אורך' מן הגדולה מהקטן לגדול. לגלול הנתונים ולהסיר כל שורה בעלת סניף אורך פחות ערך הסף(כלומר., 0.5). לסכם את הערכים בעמודה אורך סניף כדי לחשב את אורך כל הענפים שנאספו מתוך התמונה מסוכם.
- חזור על צעדים 4.11.3-4.11.5 עבור כל תמונה/גיליון עד כל הנתונים גזוז, לסכם.
- לחלק את הנתונים של כל תמונה (לסכם מספר נקודות הקצה של מסוכם סניף אורך) לפי מספר somas מיקרוגלייה בתמונה המתאימה. הזן את הנתונים הסופי (נקודות קצה/תא & סניף אורך/תא) לתוך תוכנה סטטיסטית.
הערה: הנתונים אורך תא סניף מסוכם עשויה לדרוש המרה מאורך בפיקסלים מיקרון.
5. פרקטל ניתוח
הערה: FracLac הוא מסוגל לרוץ מספר ניתוחים צורה שונה שאינם מכוסים פרוטוקול זה. הסבר מפורט יותר של FracLac של פונקציות שונות, עיין במדריך FracLac ב < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> והפניות המשויכות 2,16,19. פרקטל אנליזה מנצל את השלבים פרוטוקול 4.1-4.7 שתוארו לעיל.
- לקבוע את גודלו של רועי זה ישמש עבור כל ניתוח פרקטל. השתמש בכלי מלבן כדי לצייר את רועי. ודא בתיבת גדול מספיק כדי ללכוד את כל התא יכול להישאר עקבי לאורך כל ערכת הנתונים.
הערה: השתמש את מלבן הבחירה במקום הבחירה ביד חופשית כדי להבטיח כי כל ROIs למלבן בגודל זהה, ולכן התאים יש באותו הסולם. זה לא יהיה המקרה אם הבחירה ביד חופשית שימשו כי ImageJ יהיה התאם אוטומטית את גודל של רועי מרובע כדי להתאים את חלונות מלבני בגדלים שונים וכתוצאה מכך תאים עם סולמות שונים. בעוד צורות פרקטל בקנה מידה עצמאית, תהליך ניתוח fractal משתמש FracLac עבור ImageJ תלויה בקנה מידה16. לפיכך, יש הצורך רועי בגודל בעקביות לאורך כל אוסף נתונים. - בחר באופן אקראי מיקרוגלייה לניתוח פרקטל כל photomicrograph וכל תמונה בינארי המתאימים. בחלון מנהל רועי, בחר עדכון כדי לנעול את רועי על מיקומו של התא. להשתמש Ctrl + Shift + D כדי לשכפל את שטחה של רועי כמו חלון חדש, ולאחר מכן לשמור את התא החתוכים. על התמונה בינאריים המתאימים (מניתוח שלד), לשכפל את האזור באותו התא באמצעות מנהל רועי. חזור עד מספר מספיק של תאים נבחרו באופן אקראי לצורך ניתוח פרקטל ולשמור את כל הקבצים.
הערה: מחולל מספרים אקראיים ורשת ממוספרות יכול לשמש כדי לבחור באקראי תאים. - פתחו את התמונה בינארי עם התא בודדים. לחצו פעמיים על הכלי מברשת צבע, לקבוע את הצבעים שחור, והתאם את רוחב המברשת כנדרש. באמצעות את photomicrograph תואמת כהפניה, להשתמש במכחול כדי להסיר תאים סמוכים תהליכים, חיבור תהליכים מפוצלים של בודד את התא של ריבית. לאחר התא בינארי היה מבודד, לשמור את הקובץ הבינארי.
הערה: מחזיק 'alt' תעבור במכחול של צבע החזית (שחור) לצבע הרקע (לבן). - להמיר את התא בינארי חלוקה לרמות באמצעות סרגל הכלים ויה תהליך | בינארית | חלוקה לרמות.
הערה: ניתן להשתמש FracLac עבור J התמונה בצורות מוצק או או צורה מתווה, האמנה הנוכחית עם זאת, כדי להשתמש בצורה מתווה16. - בסרגל הכלים, לפתוח את FracLac באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תוספים | פרקטל ניתוח | FracLac ובחר לפנה ס (תיבת לספור). הגדרות רשת העיצוב , הגדר Num G 4. תחת אפשרויות גרפיקה , סמן את התיבה מדדים כדי לנתח את קמור ועיגול התוחמת של התא. בסיום, בחר ב'אישור '.
הערה: Num G הוא המספר של תיבת לספור אוריינטציות הרשת בשימוש במהלך הסריקה והוא הטווח המומלץ עבור Num G 4-12. את הגדרת Num G ואת הטווח המוצע נבדק ביסודיות ידנית FracLac16. הגדלת Num G יכול להאט באופן משמעותי חישוב פעמים. הגדרות FracLac תצטרך רק ניתן להגדיר פעם אחת בכל הפעלה. ברגע ההגדרות הוזן, לחצן הסריקה יהפוך לזמין. - בחר בלחצן הסריקה להפעיל סריקה ספירת תיבת התמונה שנבחרה.
הערה: הסריקה יפיק שלושה חלונות עם נתוני תפוקות: גוף, עיגול תוצאות, קובץ סיכום Count תיבת וסוגי לסרוק. החלון סוגי סריקה מכיל יומן של ההגדרות המשמשות, סטיות כסטנדרט גם אמצעים מסוימים. למטרות של פרוטוקול זה, החלון סוגי סריקה לא רגיל להיות סגור או לשמור לשימוש עתידי. - בחלון הול ותוצאות של מעגל , להעתיק נתונים כל הרצוי (כלומר., צפיפות, יחס span ו מעגליות) תוצאות. בחלון הסיכום Count תיבת , להעתיק את הנתונים הרצויים (כלומר., פרקטל ממד ו- lacunarity) תוצאות. להעביר את הנתונים המועתקים בקובץ Excel או תוכנה סטטיסטית.
הערה: רשימה מלאה של FracLac פלט נתונים ניתנים לאורחים, הוסברה ב FracLac עבור ImageJ ידנית16.
Representative Results
הפרוטוקולים ניתוח מורפולוגיה מיקרוגלייה המתוארים בזאת סיכום השלבים מסייעת עיבוד פלורסנט, photomicrographs DAB לניתוח morphometric. שלבים אלה מסוכמים באופן חזותי באיור 2, איור 3. מטרת השלבים היא ליצור נציג בינארי, skeletonized תמונת מודלים כראוי את photomicrograph המקורי כך הנתונים שהצטברו תקפים. לאחר יישום פרוטוקול, התוסף AnalyzeSkeleton תוצאות תמונה מתויגת שלד שממנו מספר נקודות הקצה וענף (כלומר., תהליכים) lengthcan ניתן לסכם מתוך קבצי הפלט המתקבל. נקודות קצה ונתונים אורך תהליך משמשים לאחר מכן כדי להעריך את היקף מיקרוגלייה הסתעפויות photomicrograph או ROI. איור 4 מסכם את הנתונים המתקבלים (נקודות קצה/התא ואת התהליך אורך/תא) שנאסף עם ובלי ליישום פרוטוקול. בעוד מגמות דומות קיימות, הנתונים מסוכם ב איור 4F הפכפך יותר מאלו של איור 4E. בנוסף, נתונים אלה ממחישים לרגישות מוגברת כדי לזהות הבדלים בין קבוצות כאשר הפרוטוקול מוחל. לבסוף, יש לנקוט לגבי השתנות בין המשתמש ביישום של הפרוטוקול. כזה ההבדלים מסוכמים על-ידי איור 5 איפה מאותה ערכת נתונים נותחה על ידי שני משתמשים עצמאית יישום פרוטוקול זהה כפי שסוכם לעיל.
מורפולוגיה נוספים הנתונים נאספים של תאים בודדים מבודד את תמונות בינאריות שנוצרו במהלך היישום פרוטוקול. השלבים פרוטוקול לנתח מיקרוגלייה מורפולוגיה לפני ושימוש התוסף FracLac מסוכמות באיור 6. אנו להמחיש את זה ניתוח שני שציווית (איור 6A), נפגע רקמות (איור 6B). להחליפן בתמונות של בינארי, המחולקת לרמות, קמורה הול/לבצע עיגול, ודוגמאות בתיבה ספירה עבור כל תא ניתח עם ללא הפרוטוקול יישום מוצגים באיור 6C–פ תמונות אלה מסייעים להמחיש את מקורותיה של הבדלים בנתוני מורפולוגיה אשר מסוכמות באיור 6G.
איור 1. איורים של skeletonized מיקרוגלייה עם סומא מעגלית (שיוצרת) לעומת של מקור יחיד (אופטימלי) וראשה הכיסוי המתאים בין התא skeletonized את photomicrograph המקורי- סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. פרוטוקול ליישום פלורסנט photomicrographs. איורים של פרוטוקול שלד ניתוח המוחל על photomicrograph פלורסנט עם תא אחד נחתך כדי להציג פרטים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. פרוטוקול ליישום DAB המוארים-שדה photomicrographs. איורים של פרוטוקול שלד ניתוח המוחלים על photomicrograph DAB בהיר-שדה עם תא בודד שנחתכו להראות פרטים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. ניתוח נתונים עם ובלי ליישום פרוטוקול. (א) photomicrograph דוגמה של פלורסנט IHC ותא החתוכה המתאים התיבה הצהובה (B). דוגמה בינארי ותמונות skeletonized עם (C) ללא (ד) פרוטוקול חלה כמתואר. נתוני סיכום של מיקרוגלייה נקודות קצה/התא ואת התהליך אורך/תא שציווית (לבן) נפגע רקמות בקליפת המוח (אפור) עם (E), בלי (F) מיושם הפרוטוקול. ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t של סטודנט ו- n = 3, * * מציין p < 0.01. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. ההבדלים משתמש ביישום פרוטוקול. דוגמה של המרה המקורי התמונה ואת פרוטוקול לתמונות בינארי, שלד על-ידי המשתמש 1 ו- 2 משתמש. ההבדלים בין שתי תמונות מסומנים עם התאמה עיגולים צבעוניים. תרשימי סיכום מיקרוגלייה נקודות קצה/התא ואת התהליך אורך תא נתונים באזורים במוח שציווית ונפצעו על-ידי המשתמש 1 ו- 2 משתמש. ניתוח סטטיסטי ANOVA, דוגמת גודל הוא n = 3; p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. ניתוח פרקטל עם ובלי ליישום פרוטוקול. דוגמה photomicrographs החתוכה של מיקרוגלייה שציווית (A), קליפת פצוע (B) המתאימים בינארי (C), ותמונות חלוקה לרמות (D) כתוצאה עם וללא פרוטוקול מוחל. המשויך קמור (כחול), התוחם את מעגל (ורוד) עבור צורות חלוקה לרמות מתאימות (E) משמשים לחישוב הצורה צפיפות, span יחס ולאחר מעגליות (G). תיבת לספור שיטת מאויר באיורים (F), השתמשו פרקטל ממד (DB), lacunarity (λ) חישובים (G). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
מיקרוגלייה התאים מכוילים פיזיולוגיה, פתולוגיה בתוך שלהם המיקרו-המחשבים, להציג מגוון רחב של אפשרויות מורפולוגיות2 עדין7,14 והן פגיעה בוטה8. השימוש ImageJ פרוטוקולים גורם מיקרוגלייה מורפולוגיה כימות נגיש כל המעבדות כפלטפורמה, תוספים בתוכנת עיבוד תמונה פתוח. בעוד הפרוטוקול המתואר ממוקדת עיבוד וניתוח תמונה באמצעות תוכנה זו, מרקם של איסוף נתונים, תוקף ומהימנות מתחיל IHC ומצויין מיקרוסקופ. פרוטוקול זה משמש לשיפור בינארי, שלד וייצוגי חלוקה לרמות של photomicrographs כולו, תאים בודדים אבל לא יכול לקחת את מקומו של צביעת IHC המסכן, מיקרוסקופיה שתוצאתו ניגודיות נמוכה, מטושטש, או עיוות תמונות. כמו שיקול נוסף, חייבים להקפיד לא לשטח על רקמת המוח במהלך האחסון, לפני חלוקתה, אשר באופן בלתי הפיך הפיצולים מיקרוגלייה מורפולוגיה. לבסוף, במסגרת ניסוי, מיקרוגלייה חייב לדימות שימוש באותו הסולם, כמו גם המיקרוסקופ אותו. מכשור, מטרות ותוכנות משתנים בין מיקרוסקופים אשר לגרום photomicrographs בגדלים שונים למרות מטרות דומות, לשנות את הפרטים, כמו גם את מספר התאים בתוך כל מסגרת. לדוגמה, ייבוא תמונות באמצעות מטרה X 40 על SPII לייקה תוצאות מספר כפול של תאים ופחות פרט מאשר רכישה באמצעות של 880 Zeiss. דבר זה חשוב במיוחד עבור תא הסתעפויות נתונים שנאספו מן המסגרת כולה ולא תא בודד, כמו זה הופך להיות עניין של נתוני דגימה.
באופן כללי, ניתוח שלד אשר מנצל את כל photomicrograph מקדים הניתוח פרקטל תא בודד משתי סיבות. הסתעפויות תא הקובע כל התאים photomicrograph היא מהירה כאשר לעומת הניתוח פרקטל תא בודד, עשוי להיחשב ככלי מיון אם הזמן הוא גורם. בנוסף, תמונות בינאריות נגזר במהלך ניתוח שלד משמשים לניתוח פרקטל. ברגע שעברה דימות, ישנם מספר שלבים קריטיים אשר עשויים להשפיע על תוצאות ניתוח שלד ולהציג למשתמש-השפעה. פרוטוקול השלבים ברוב משתנה בין משתמשים שלב 4.2 (הגדלת תמונות בהירות), צעד 4.5 (קביעת הסף). במידת האפשר, מספר של האופטימלית כדי להגדיל את הבהירות (המחוון מקסימום או מינימום בין 0-255) הוא נחוש והחזיק קבועה עבור כל המשתמשים ותמונות. איפה התמונה השתנות גדולה, המשתמש יכול לבחור במקום זאת בהירות כי ישתנה בין תמונות. לחלופין, אם תמונות הינם בהירים והוא ניגודיות גבוהה, ואז הגברת בהירות יכול להיות מושמט, סף יכול להיות מוגדר באמצעות מסנן סף מיוחדים (למשל., הואנג) ולא ברירת המחדל משתנה יותר. ברגע אופטימיזציה, הפרמטרים צריך להיות דבקה על מנת למזער את המשתמש נוספים-השפעה.
דוגמה של השתנות המשתמש מוצגת באיור5. ערכי נתונים היו עלה ב משתמש 1 לעומת משתמש 2, ולכן השתנות יהיה גידול אם משתמש 1 ו- 2 משתמש תרם אוסף נתונים. דוגמה של הבדלי משתמש 1 ו- 2 משתמש בינארי ותמונות skeletonized מודגשים על-ידי עיגולים צבעוניים (איור 5). במקרה זה, שני המשתמשים היו מאומנים בקצרה סטודנטים לתואר ראשון עם התמחות מוגבל מיקרוגלייה. פיקוח קבוע והדרכה על ידי מיקרוגלייה מומחה יחד עם פרוטוקול מוגברת הדרכה2 יכול להפחית את ההשתנות הבין-משתמש. אמנם לא העריכו כאן, ניתוח פרקטל הוא פחות להשתנות בין המשתמש כי בינארי תאים מבודדים באופן ידני והן באופן אישי photomicrograph, ולא להסתמך אך ורק על סף כדי לקבוע מיקרוגלייה צורות. עם זאת, כל השיטות יש כמה השתנות בין משתמשים. לכן, משתמש בודד (באופן אידיאלי, מאומנים על ידי כמה מומחיות בתאים מיקרוגלייה) צריך להשלים את איסוף הנתונים עבור כל הנתונים (dataset).
שינויים נוספים יכול להתבצע בקלות על פרוטוקול זה, יהיה תלוי באיכות התמונה, ואת המאמצים לנקוט כדי להפחית את הרעש ולהבטיח תהליך קישוריות. לדוגמה, אם ניגודיות נאותה, לאחר מכן חידוד מסיכה אינה נחוצה, יכול להיות מושמט. . זה חכם למטב ולסיים הפרוטוקול עבור קבוצה ספציפית של תמונות, המקרים ניסיוני והן פקדים, לפני איסוף נתונים מתוך סדרה שלמה. לבסוף, תוספים נוספים עשוי לשמש במקום אחרים כדי להבהיר או חידוד תמונות לא מתוארים פרוטוקול זה כגון להתרחב או חידוד.
היתרונות של פרוטוקול זה הם שלה אוניברסלי זמינות ויכולת הסתגלות. בנוסף, הערכת הסתעפויות התא באמצעות AnalyzeSkeleton הוא החלים photomicrograph שלמה ומהירה. אחד היתרונות של גישה ניתוחית מרובת-תאים הוא המוקד של האזור כולו במקום תאים בודדים. לכן, זה אפשרי להעריך במהירות את הסתעפויות הממוצע (מבחינת נקודות קצה, תהליך האורך) כל מיקרוגלייה בתוך התמונה. ניתוח שלד מספקת ניתוח של תאים מרובים: דגימה נתונים מבחינת מספרי הטלפון הנייד זה לא יכול להיות מתאימים על ידי פרקטל ניתוח בשל ההשקעה הזמן הנדרש כדי לבודד תאים בודדים מ- photomicrographs. מופע איפה זה יכול להיות המתאימה ביותר תהיה הקרנה מיקרוגלייה מורפולוגיות ב proximities כדי פגיעה נקודתית. מגבלה אחת היא עיבוד תמונה כל השדה ליצור מודלים שלד של IHC photomicrographs הוא לא מושלם כאשר לעומת הגישה לתא בודד זמן רב יותר. בנוסף, ניתוח האזור אינו מתאים לנסיבות איפה מיקרוגלייה מורפולוגיות שונים באופן מהותי בתוך אותו שדה. לבסוף, שיטה ניתוח זו היא תלויה ספירת התאים, פרמטר זה עשוי להיות שונה בין תנאי הניסוי.
ניתוח פרקטל מתנהלת על תא בודד ומשלים ולכן התא הממוצע הסתעפויות נתונים הפלט המתבררת מניתוח שלד. למרות הרבה יותר זמן רב, השקעה זו מניבה מגוון רחב של נתונים morphometric. לדוגמה, בתא צפיפות, יחס span, ומתארים מעגליות נתונים הגודל, התארכות, והצורה של החלוקה לרמות תא, בהתאמה. ממד פרקטל, lacunarity לסכם את המורכבות תא והטרוגניות צורה, בהתאמה. סיכום מעמיקה יותר של כיצד מחושב כל פרמטר ולא איך הנתונים עשוי להתפרש ידנית אינטראקטיבי16 ושירות בכזה פירוט צריך להיחשב ביחס שאלת המחקר הספציפי. הפרוטוקול המתואר תוצאות כלי רגיש לכמת שינויים קטנים במורפולוגיות מיקרוגלייה 2D שעלולות להתרחש בתנאים הפיזיולוגיות, פיפטות. ניתוח morphometric נוספים כגון אחידות, קמירות טופס גורם16,20 ייתכן אם יצירת צורות תלת-ממדיות.
פרוטוקול פיתוח והתאמה היא רציפה, המונעת על-ידי המשתמש. זה הוארך פלורסצנטיות8 DAB/בהיר-שדה תמונות7 , אבל עדיין לא הפרפין רקמות מוטבעים. . זה תוספת, זה יכול לשמש בשילוב עם תוכנות קנייניות כמו Imaris לניתוח נוסף. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם למגוון של פיזיולוגיה, אינה מוגבלת מיקרוגלייה אך ניתן להחיל את כל תאים או רקמות עם דפוסי מסוים או צורות הניתנות לזיהוי בשיטות IHC. לבסוף, עם גודל המדגם מספיק, ניתוח multivariate או אשכול ניתן ליישם stratify מיקרוגלייה על פי המורפולוגיה12,21; זהו מידע משמעותי כמו מורפולוגיה מיקרוגלייה הוא מחוון חיוני של פונקציות מיקרוגלייה תגובות על סביבתם. ההערכה על גיוון מורפולוגיות microglial הוא הרחבת וחשוב להבין באופן מלא את האינטראקציות נוירון-עכשיו, דונלד-וסקולרית במהלך מחלה ובריאות. צמיחה בתחום זה מועצמת על ידי פרוטוקולים מפותח, קל לשימוש, לשחזור לכמת ולסכם מורפולוגיה מיקרוגלייה באמצעות משתנים רציפים מרובים.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה קיבל תמיכה כספית מ- NINR (F32NR013611). נשמח עוד יותר להכיר ולהודות המפתחים של AnalyzeSkeleton(2D/3D) ו- FracLac (Arganda-קאררס. et al. , Karperien. et al., בהתאמה) ללא ניתוח הנתונים המתוארים בזאת שלא יהיה אפשרי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
| Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
| Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
| 4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |
References
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis. Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).
- Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. Rod microglia: a morphological definition. PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).
- Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus. Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).
- Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury. Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion. J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Xu, H., et al. Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers. J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).
- Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments. Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).
- Soltys, Z., et al. Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis. J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).
- Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study. Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice. Neuroscience. 339, (2016).
- Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Karperien, A. FracLac for ImageJ. , Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm (2013).
- Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction. Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2014).
- Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).
- Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. 3D quantitative analysis of microglial morphology. available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis. Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).
