Summary
Microglia 두뇌 면역 세포를 조사 하 고 양적 평가 될 수 있는 형태 론 적 변화를 통해 변경 된 두뇌 생리학에 반응 하는. 이 프로토콜 개요는 ImageJ 셀 분파, 복잡성, 모양 등 통계에 따라 연속 데이터 microglia 형태를 나타내는 분석 프로토콜을 기반으로 합니다.
Abstract
Microglia 뇌 식 세포 두뇌 항상성에 참여 하 고 지속적으로 장애, 부상 및 질병에 대 한 그들의 환경 조사는. 첫 번째 응답자로 microglia 신경 및 명과 장애를 완화 하기 위해 중요 한 기능 그리고이 과정에서 그들은 다양 한 형태 론 적 변화를 받게. Microglia 형태학 기술적 분류 될 수 있다 또는, 또는, 셀 분파, 복잡성, 모양 등의 매개 변수에 대 한 지속적인 가변으로 측정할 수 있습니다. Microglia 측정 방법 단일 셀에 적용 하는 동안 몇 가지 기술을 여러 microglia 전체 photomicrograph에 적용 됩니다. 이 방법의 목적은 여러 계량 하 고 쉽게 사용할 수 ImageJ 프로토콜을 사용 하 여 단일 셀. 이 프로토콜은 단계 요약 ImageJ 플러그인 대표 이진 및 해당 이미지에 형광 고 밝은 필드 photomicrographs를 변환 하 고 그들을 분석 하는 것이 좋습니다 (2D/3D) AnalyzeSkeleton 및 FracLac 소프트웨어 플러그인을 사용 하 고 형태 데이터 컬렉션에 대 한입니다. 이러한 플러그인의 출력 프로세스 끝점, 교차점, 및 길이 뿐 아니라 복잡성, 셀 모양 및 크기 설명자 셀 형태를 요약합니다. 여기에 설명 된 뼈대 분석 프로토콜은 FracLac 무료 개별 셀 분석을 제공 하는 반면 전체 photomicrograph 또는 관심 (ROI)의 지역 내에서 여러 microglia 지역 분석에 대 한 적합 합니다. 결합, 프로토콜은 목표, 건강 하 고 손상 된 두뇌에 다양 한 microglia 형태학 사이 충에 사용 될 수 있는 민감한, 그리고 종합 평가 도구를 제공 합니다.
Introduction
Microglia 있는에 대 한 즉각적이 고 다양 한 형태 론 적 응답 변경 가능성의 연속체를 따라 뇌 생리학1 드 없는 및 amoeboid 형태학2에 하이퍼 분파와 매우 복잡 한 형태학에서 다양 . Microglia 또한 편광 및 막대 모양의3될 수 있습니다. Microglia 셀 분파 일반적으로 여러 프로세스 하는 데 복잡 한 모양으로 정의 된 고 셀 당 끝점의 수와 세포 프로세스의 길이 자주 보고 됩니다. Microglia 연속 셀 잡담 그리고 vivo에서 운동 성4,5신경 그리고 glial 기능을 정밀 하 게 조정 된다, 때문 microglia 형태학에 다양 한 세포 기능 및 장애의 지표로 사용할 수 있습니다. 두뇌. 양적 접근 필요 적절 하 게 이러한 morphologic 변화의 다양성을 설명 하 고 없는 셀 (예: 간 질5,6 미묘한 생리 물결에서 발생 하는 간의 차이 구별 하는 그리고 뇌 진 탕7) (스트로크8) 같은 심한 부상에 뿐만 아니라. 형태학 정량화7,8,9,10,11,12,,1314 의 사용 증가 건강 및 질병 동안 microglia 형태학의 전체 다양성을 발표할 예정 이다. 현재 연구 ImageJ 플러그인 microglia의 형광 또는 비 형광 photomicrographs에서 microglia 형태를 요약 하는 데 필요한의 단계적 사용 immunohistochemistry (IHC) 후 고정된 쥐 나 조직에 취득 세부 사항.
중앙 분석 기술을 설명 하는 ImageJ 플러그인 AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, 2010 년 큰 유 방 구조, 계량에 개발 및 FracLac16, ImageJ 및 프랙탈 분석을 통합 하는 2014 년 개발 계량 개별 microglia 모양. 이러한 플러그인 전체 photomicrographs 이내 microglia 분파의 신속한 분석 또는 photomicrograph에서 정의 된 투자 수익의 여러 microglia를 제공합니다. 이 분석은 혼자 또는 보완 프랙탈 분석에 사용할 수 있습니다. 단일 셀 프랙탈 분석 (FracLac) 시간의 투자가 필요 하지만 microglia 복잡성, 모양 및 크기에 관한 여러 형태로 출력을 제공 한다. 두 도구를 사용 하 여 중복, 셀으로 분파는 셀 복잡성, 상호 보완적 이며 여러 매개 변수 조합 데이터 집합12,17내 다양 한 microglia 형태학 사이 구별 하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
모든 실험에 의해 승인 되었고 아리조나 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 NIH 지침에 의해 설립 하는 지침에 따라 수행. 동물 통증과 불편을 최소화 하기 위해 주의 되었다. 안락사 메서드는 승인 된 프로토콜에 따라와 isoflurane 마 취하에 자 궁 경부 잘린 구성 합니다.
1. 조직 준비
참고: 셀 형태를 유지 하기 위해 고정 된, cryoprotected 조직 샘플에 microglia 형태 분석을 실시 합니다. 다음은 준비 하 고 직접 형광 IHC에 대 한 고정된 조직 슬라이스 표준 프로토콜입니다.
- 원하는 실험 후 및 표준 실험실 프로토콜에 따라 안락사 동물에서 마우스 또는 쥐 두뇌를 제거 합니다. 10 mL 유리병 4 ° c.에 24 h에 대 한 4 %paraformaldehyde 솔루션의 5 mL를 포함 하는 뇌를 넣습니다 다음 헹 구 고 30% 자당 인산 염의 5-10 mL에 장소 4 ° c.에서 72 h에 대 한 솔루션 (PBS, 0.01 M)를 버퍼링 경우는 톰와 단면 전체 두뇌 또는 cryostat와 조직 단면까지-80 ° C에서 4 ° C에서 저장 합니다.
참고:이 프로토콜은 아직 테스트 되지 조직 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 슬라이스를 사용 하 여. - 섹션 원하는 섹션 두께와 방향-20 ° c.에 cryoprotection 솔루션 (50mm PBS, 에틸렌 글리콜, 글리세롤) cryostat 또는 톰 및 저장소 부동성 섹션을 사용 하는 뇌 조직
참고:이 프로토콜은 성공적으로 실시 되었습니다 두께에서 50 µ m에서 200 µ m에 이르는 코로나 조직 단면도에. 조직이 섹션 보다 50 µ m 두꺼운 직물 단면도에서 microglia 프로세스의 전체 범위를 캡처하지 수 있습니다, IHC 얼룩 수 있습니다 완벽 한 조직으로 항 체 침투 때문. 조직 중 하나는 혀끝에서 sectioned 또는 화살 방향 되며이 선택 공부 실험 목표 및 두뇌 지구에 따라 달라 집니다.
2입니다. Immunohistochemistry
참고: 골격 및 프랙탈 분석 방법은 형광 또는 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) IHC에 적용할 수 있습니다. 다음 표준 형광 IHC 프로토콜 이며 필요에 따라 대체 될 수 있습니다. 형광 IHC 소량 IHC에 비해 셀 공정의 뛰어난 시각화를 생성 합니다.
- 4 mL 유리 유리병 (최대 15 마우스 뇌 섹션/유리병)으로 조직 단면도 배치 하 고 10% 말 혈 청, PBS (0.01 M), 0.5% 트리톤, 실 온 (23 ° C) 1 시간에서 0.04% 할머니3 를 포함 하는 솔루션의 1 mL와 함께 품 어.
- 실 온에서 3 시간 PBS (0.01 M)를 가진 5 분 동안 세척.
- 1 차적인 항 체 (Iba1, 1:1, 000) 72 h 1 mL의 PBS (0.01 M), 0.5% 트리톤, 0.04% 할머니3를 포함 하 고 (NaN3 효과 보존)을 적용 하는 솔루션에 대 한 실 온에서 함께 품 어.
- 실 온에서 3 시간 PBS (0.01 M)를 가진 5 분 동안 세척.
- 2 차 항 체 (반대로 토끼 488, 1: 250) 4 h 1 mL의 PBS (0.01 M), 0.5% 트리톤, 0.04% 할머니3 를 포함 하는 솔루션에 대 한 실 온에서 커버와 함께 품 어
- 실 온에서 3 시간 PBS (0.01 M)를 가진 5 분 동안 세척.
- 좋아한다 슬라이드 (번호 및 기본 설정에 따라 방향) 뇌 조직 단면도 탑재, 슬라이드, 소프트 세트 장착 매체를 적용 하 고 조직에 배치 하는 coverslip. 4 ° c.에 슬라이드 저장
참고: 1.5 유리 coverslip 두께 confocal 영상에 대 한 필요 합니다. 높은 점도 조직 압축 하지 않습니다 때문에 hard-set 설치 미디어에 비해 형태를 유지 하는 최고 소프트 세트 기본 장착 매체입니다.
3입니다. 영상
- 밝은 분야 또는 confocal 현미경은 20 X 객관적인 또는 더 큰를 사용 하 여 z-스택 수집 기능을 사용 하 여 뇌 조직 섹션에서 이미지 Iba1 긍정적인 세포.
참고: 매개 변수 및 소프트웨어 설정 이미징 실험에서 모든 photomicrograph 인수에 대 한 일정 해야 합니다. 우수한 프로세스 정보 X 40 또는 63 X 목표를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 그것은 전체 photomicrograph 또는 더 큰 photomicrograph 내의 다중 셀 ROI를 여기에 설명 된 뼈대 분석 프로토콜을 적용할 수 있습니다.- 적절 한 소프트웨어 설정을 특정 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 8 비트 이미지를 취득 합니다.
참고: 8 비트 사후 수집에 파일의 변환 데이터 컬렉션을 왜곡 수 있습니다. - 적어도 30 µ m z-적절 한 소프트웨어 설정을 특정 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 2 µ m 간격 보다는 더 이상 스택을 취득.
참고: 현미경 및 소프트웨어는 X, Y 및 Z 축에 이미지 수집 허용 합니다. Z-스택 증가 될 수 있습니다, 그리고 간격 추가 microglia 정보를 제공 하도록 감소 될 수 있습니다. 교환에서는, 시간 이미징 증가할 것 이다. 형광 현미경 검사 법에 대 한 나이 키스 트 샘플링을 가능한 사용 합니다.
- 적절 한 소프트웨어 설정을 특정 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 8 비트 이미지를 취득 합니다.
- Tif 파일로 또는 현미경 소프트웨어에 의해 필요한 모든 파일을 저장 합니다.
- ImageJ에서 Tif 파일을 열고 이미지를 클릭 하 여 채널을 분할 하는 도구 모음을 사용 하 여 | 컬러 | 분할 채널, 및 이미지를 클릭 하 여 이미지를 스택 | 스택 | 프로젝트 X | 최대 강도 프로젝션 적절 한. .Tif 파일로 저장 합니다.
4. 기초 분석
- 피지에서 ImageJ를 다운로드 < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. 개별 플러그인 다운로드에서 AnalyzeSkeleton(2D/3D) < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>15 FracLac에서 다운로드 및 < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>16.
참고: 이진 해당된 이미지에는 photomicrograph를 변환 하는 전체 프로세스는 1 분 미만 걸립니다. - 형광 photomicrograph를 사용 하는 경우 이미지는 8 비트를 확인 하 고 최고의 모든 긍정적인 얼룩 시각화를 회색조로 변환. 도구 모음을 사용 하 고 이미지를 클릭 하십시오 | 조회 테이블 | 회색. DAB 필드 밝은 사진, 처음 사용할 때 사용 하는 경우 FFT 대역 통과 필터 플러그인 ( 프로세스를 클릭 하 여 도구 모음을 사용 하 여 | FFT | 대역 통과 필터) 다음 회색 음영으로 변환.
참고:이 프로토콜의 목적을 위해 ImageJ 기본 설정은 FFT 대역 통과 필터에 대 한 충분 한 (40, 아니 스트라이프 억제 아래로 3 픽셀까지 필터) 됩니다. FFT 대역 통과 필터 적용 이미지의 전반적인 더 큰 모습을 유지 하면서 잡음 (작은 기능)를 제거 합니다. 이것은 밝은 필드 이미지에 특히 유용 합니다 어디 분할 조직에서 균열 배경으로 나타날 수 있고 따라서18골격 분석 복잡 하 고. - 이미지 너무 희미 microglia 프로세스를 시각화 수 없습니다 경우 밝기 및 대비를 조정 합니다. 도구 모음을 사용 하 고 이미지를 클릭 하십시오 | 조정 | 밝기/대비. 히스토그램의 더 가장자리까지 필요에 따라 최소 또는 최대 슬라이더를 조정 합니다.
참고: ImageJ에서 밝기 및 대비 변경 됩니다 픽셀 값이 변경 되지 않는 이미지의 룩 업 테이블 (LUT)을 업데이트 하 여. 최대 및 최소 슬라이더 표시 범위 위에 나타나는 화이트 255 픽셀 값 및 0 블랙18나타나는 아래의 픽셀 값의 하위 및 상위 제한을 제어 합니다. 형광 photomicrographs의 경우 최대 슬라이더 사용 되어야 한다, 반면 최소 슬라이더 DAB microglia 스테인드의 photomicrographs 사용 됩니다. - 프로세스를 클릭 하 여 도구 모음을 사용 하 여 대비를 더욱 높이기 위해 언샵 마스크 필터를 실행 | 필터 | 언샵 마스크. 이 프로토콜, ImageJ의 기본 설정의 목적을 위해 (3의 픽셀 반경을 0.6의 무게를 마스크 하 고) 사용 됩니다.
참고: 언샵 마스크 선명 하 고 흐리게 버전의 원본에서 이미지 (언샵 마스크)를 빼서 고 결과 이미지는 원본 이미지의 고대비 버전을 결합 하 여 이미지의 가장자리 기능을 향상 시킵니다. 따라서 언샵 마스크 필터 세부 정보를 생성 하지 않습니다 하지만 오히려 이미지에 기존 정보를 명확히. 설정 변경 어떻게 모호한 언샵 마스크 반경 (되며 따라서 얼마나 많은 흐림 제거 될 것 이다), 그리고 마스크 무게 설정 변경 대비 언샵 마스크와 병합할 것입니다 (따라서 최종 이미지의 대비를 조정 합니다). - 언샵 마스크에 의해 생성 된 salt-and-pepper 잡음 제거를 despeckle 단계를 수행 합니다. 프로세스를 클릭 하 고 도구 모음을 사용 하 여 | 소음 | 얼룩 제거.
참고: 얼룩 제거 각 픽셀의 3 × 3 동네에서 중간 값으로 대체 하 여 salt-and-pepper 노이즈를 제거 합니다. 효과18가장자리 선명도 영향을 주지 않고 강도 outliers 중간 픽셀으로 대체 됩니다. - 이미지를 클릭 하 여 도구 모음을 사용 하 여 이진 이미지를 변환 | 조정 | 임계값.
참고: 임계 처리 배경 대 관심의 기능으로 회색 음영 이미지를 stratifies 하 고 이진18으로 이미지를 변환 합니다. - 닫기-despeckle을 적용 하 고 제거 outliers 기능: 결과 이진 이미지에 있을 수 있습니다 단일 픽셀 배경 잡음 및 프로세스 사이의 간격.
- 프로세스를 클릭 하 여 도구 모음을 사용 하 여 despeckle 함수 적용 | 소음 | 얼룩 제거.
참고: 이진을 얼룩 제거 적용 이미지는 모든 나머지 단일 픽셀 노이즈를 제거 합니다. - 프로세스를 클릭 하 여 도구 모음을 사용 하 여 닫기 함수 적용 | 이진 | 가까운.
참고:이 플러그인 그들은 최대 2 픽셀을 구분 하는 경우 두 개의 어두운 픽셀을 연결 합니다. - 프로세스를 클릭 하 여 도구 모음을 사용 하 여 제거 outliers 함수 적용 | 소음 | Outliers를 제거.
참고:이 프로토콜의 목적을 위해 밝은 outliers 2 픽셀 반경 및 50의 임계값으로 타겟팅 됩니다. 이 플러그인은 특정 값 (임계값)18이상으로 일탈 하는 경우 주변 지역에서 중간 픽셀 밝은 또는 어두운 국외 자 픽셀을 대체 합니다.
- 프로세스를 클릭 하 여 도구 모음을 사용 하 여 despeckle 함수 적용 | 소음 | 얼룩 제거.
- 미래 사용 및 프랙탈 분석에 대 한 별도 파일로 이미지를 저장 하 고 skeletonize 프로세스를 클릭 하 여 도구 모음을 사용 하 여 이미지 | 이진 | Skeletonize.
- 해당된 이미지를 선택 하 고 플러그인 플러그인을 클릭 하 여 도구 모음을 사용 하 여 AnalyzeSkeleton(2D/3D)를 실행 | 골격 | 해골을 분석, 분기 정보 상자를 확인 하 고.
참고: 그것은 가능성이 이미지 처리 추가 나의 위의 제안된 단계 삭제와 최적화를 요구할 것 이다입니다. 이 과정에서 해당된 이미지 뼈대와 원본 이미지의 오버레이 생성 하 여 정확도 대 한 평가. Somas 단일 기원 포인트 프로세스 센터;에서 집중적으로 해야 합니다. 원형 somas 데이터를 혼동 하 고 프로토콜 조정 피해 야 한다. 원형 somas 대 단일 시작점의 예는 그림 1에서 그림입니다.
일반적인 문제 비 대표 해골 하 고 솔루션을 제안:
- 너무 희미 한 이미지: 그레이 스케일으로 변환, 밝기/대비 슬라이더를 조정 및 언샵 마스크 적용
- 너무 많은 배경: 밝기/대비 슬라이더를 조정, Despeckle을 적용 및 outliers를 제거
- (특히 이미지에 대 한 형광) 해당된 이미지에서 원형 somas: FFT 대역 통과 필터 및 언샵 마스크 적용
- (특히 이미지에 대 한 밝은 분야) 조직에: FFT 대역 통과 필터를 적용 및 얼룩 제거
- 결과에서 모든 데이터를 복사 하 고 지점 정보 출력 및 Excel 스프레드시트에 데이터를 붙여 넣습니다.
- Excel에서 데이터 IHC와 이미지 획득에서 발생 하는 뼈대 조각을 제거를 정돈 한다.
- 해골 분석에서 원시 데이터 출력 실험 통합 문서 복제 하는 파일 이름에 트림을 추가 합니다. 모든 후속 데이터 트리밍 해야 나중에 사용 및 참조에 대 한 원시 데이터를 보존 하기 위해 복제 된 통합 문서에서 발생 합니다.
- 결정 조각 길이 ImageJ에 해당된 이미지를 열고 선 도구를 선택 하 여 데이터 집합에서 잘립니다. 몇 조각, 복용의 평균 길이 측정 하 고 컷오프 값에 결정.
참고: 여기에 제시 된 데이터의 목적을 위해 원하지 않는 조각 위한 컷오프 길이 0.5입니다. 이 값은 데이터 집합에 걸쳐 일관 되어야 합니다. - 사용자 지정 클릭 정렬 및 필터 하 여 Excel 스프레드시트를 정렬 | 사용자 지정 정렬. "끝점 복" 큰에서 작은 하 고, "Mx 분기 pt" 큰에서 작은에 의해 새로운 수준에 의해 정렬 합니다.
- 컷오프 값 보다는 더 적은의 최대 분기 길이 2 끝점에 있는 모든 행을 제거 (즉,., 0.5). 이미지에서 합계 끝점의 총 수를 계산 하려면 끝점 열의 데이터 수집.
- 지점 정보 데이터에 대 한 반복: 가장 큰에서 가장 작은 '분기 길이'에 의해 정렬. 데이터 하 고 길이가 지점 컷오프 값 보다 작은 모든 행 제거(즉,., 0.5). 이미지에서 수집 하는 모든 분 지의 총계 길이 계산 하기 위해 분기 길이 열의 값 합계.
- 모든 데이터가 정돈 되어 표현 될 때까지 모든 이미지/시트 4.11.3-4.11.5 단계를 반복 합니다.
- Microglia somas 해당 이미지에서의 수 (끝점의 수를 표현 및 표현 하는 분기 길이) 각 이미지에서 데이터를 나눕니다. 통계 소프트웨어에 최종 데이터 (끝점/셀 & 분기 길이/셀)를 입력 합니다.
참고: 요약된 분기 길이/셀 데이터 마이크론 픽셀에 길이에서 변환을 해야 합니다.
5. 프랙탈 분석
참고: FracLac은이 프로토콜에서 다루지 않은 다른 모양 분석의 숫자를 실행 수 있습니다. FracLac에 대 한 더 자세한 내용은 다양 한 기능에서 FracLac 설명서를 참조 하십시오 < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> 및 관련된 참조 2,,1619. 프랙탈 분석 프로토콜 단계 4.1-4.7 위에서 설명한 사용 합니다.
- 모든 프랙탈 분석을 위해 사용 될 것입니다 투자 수익의 크기를 결정 합니다. 사각형 도구를 사용 하 여 투자 수익을 그릴. 상자 전체 셀을 캡처할 수 확인 하는 데이터 집합에 걸쳐 일관성이 남아 있을 수 있습니다.
참고: 되도록 모든 ROIs는 같은 크기의 사각형 셀 같은 규모를가지고 하는 따라서, 자유 선택 보다는 오히려 직사각형 선택 영역을 사용 합니다. ImageJ는 자동 스케일 다른 크기의 사각형 창 다른 비늘으로 셀에 결과 맞게 평방 투자 수익 때문에 자유 선택 사용 되 면이 경우를 않을 것 이다. 프랙탈 도형은 규모에 관계 없이, 하는 동안 ImageJ를 위한 FracLac를 사용 하 여 프랙탈 분석 프로세스 규모16에 따라 달라 집니다. 따라서, 데이터 수집을 통해 지속적으로 크기의 투자 수익에 대 한 필요는. - 각 photomicrograph에 해당 바이너리 이미지 프랙탈 분석 microglia를 임의로 선택 합니다. 투자 수익 관리자 창에서 업데이트 셀의 위치에 투자 수익을 잠그려면 선택 합니다. Ctrl + Shift + D를 사용 하 여 새 창으로 ROI 내의 영역을 복제 하 고 자른된 셀을 저장 합니다. (기본 분석)에서 해당 바이너리 이미지에 ROI 관리자를 사용 하 여 동일한 셀 영역을 복제. 반복 때까지 충분 한 개수의 셀 프랙탈 분석을 위해 임의로 선택 되었습니다 및 모든 파일을 저장 합니다.
참고: 난수 생성기 및 번호 표는 임의로 셀 선택 사용할 수 있습니다. - 개별 셀 바이너리 이미지를 엽니다. 페인트브러쉬 도구를 두 번 클릭, 검정, 색을 설정 하 고 필요에 따라 브러쉬 폭을 조정. 일치 하는 photomicrograph를 참조 하 여, 인접 셀 프로세스 제거, 조각난된 프로세스, 연결 및 관심의 세포를 분리 하는 붓을 사용 합니다. 일단 이진 셀 격리 하고있다, 이진 파일을 저장 합니다.
참고: ' Alt ' (흰색) 배경색에서 전경색 (검정색) 붓을 전환 됩니다. - 프로세스를 통해 도구 모음을 사용 하 여 개요를 이진 셀 변환 | 이진 | 개요.
그러나 참고: 이미지 j FracLac 어느 단단한 모양에 사용할 수 있습니다 또는 모양 설명,, 현재는 모양을 사용 하 여 설명16. - 도구 모음에서 열기 FracLac 플러그인을 클릭 하 여 도구 모음을 사용 하 여 | 프랙탈 분석 | FracLac (상자 계산) BC를 선택. 그리드 디자인 설정에서 Num G 4로 설정 합니다. 그래픽 옵션에서 볼록 선체와 셀의 경계 원 분석 통계 상자를 확인 합니다. 완료 되 면 확인을 선택 합니다.
참고: Num G 상자 검색 중 사용 하는 그리드 방향 계산의 수 이며 Num G에 대 한 권장된 범위는 4-12. Num G 설정 및 제안 된 범위는 FracLac 수동16에 철저 하 게 검토 했다. Num G 증가 크게 계산 시간을 느려질 수 있습니다. FracLac 설정은 세션 당 한 번에 설정할 수 합니다만. 일단 설정을 입력 스캔 버튼 사용할 수 있게 됩니다. - 선택한 이미지 상자 세 검사를 실행 하려면 검색 버튼을 선택 합니다.
참고: 스캔 데이터 출력 3 창을 생성 됩니다: 선체 및 원형 결과, 상자 개수 요약 파일, 스캔 형식. 스캔 형식 창에 사용 된 설정의 로그를 포함, 뿐만 아니라 표준 편차 특정 측정 한다. 이 프로토콜의 목적을 위해 스캔 형식 창 사용 되지 않습니다 및 수 있습니다 닫거나 나중에 참조할 저장. - 선체 및 원형 결과 창에서 원하는 모든 데이터를 복사 (즉., 밀도, 스팬 비율, 그리고 순환) 결과. 상자 수 요약 창에서 원하는 데이터를 복사 (즉., 프랙탈 차원과 lacunarity) 결과. 복사한 데이터를 Excel 파일 또는 통계 소프트웨어를 전송.
참고:는 FracLac의 전체 목록 출력 데이터는 제공 하 고 철저 하 게 ImageJ 수동16FracLac에 설명 했다.
Representative Results
여기에 설명 된 microglia 형태 분석 프로토콜 요약 단계 형광 및 형태학 분석에 대 한 한 덩어리 photomicrographs를 처리 하는 데 도움이. 다음이 단계는 그림 2 에 요약 시각적으로 그리고 그림 3. 이 단계의 목표는 축적 된 데이터는 유효 적절 하 게 원래 photomicrograph 모델 대표 이진 하 고 해당 이미지를 만드는 것입니다. 응용 프로그램 프로토콜, 후 AnalyzeSkeleton 플러그인에서 태그 해골 이미지에서 결과 끝점 및 지점 수 (즉., 프로세스) lengthcan 결과 출력 파일에서 요약 될. 끝점 및 길이 데이터 처리 다음 microglia 분파 photomicrograph 또는 투자 수익의 정도 추정 하는 데 사용 됩니다. 그림 4 에 결과 데이터 (끝점/셀 및 프로세스 길이/셀)와 프로토콜 응용 프로그램 없이 수집 요약 되어 있습니다. 유사한 동향은 존재, 그림 4 층 에 요약 데이터 그림 4E에 비해 적은 변수 있습니다. 또한, 이러한 데이터 프로토콜을 적용 하는 경우 그룹 간의 차이 감지 하 감도 증가 설명. 마지막으로, 해야 합니다 주의 프로토콜의 응용 프로그램에서 간 사용자 변화에 관한 합니다. 이러한 차이 그림 5 는 같은 데이터 집합 두 개의 독립적인 사용자가 위에 요약 된 것 처럼 동일한 프로토콜을 적용 분석 했다 요약 된다.
추가 형태 데이터 프로토콜 응용 프로그램 중에 만들어진 바이너리 이미지에서 고립 된 단일 셀에서 수집 됩니다. 분석 하기 전에 microglia 형태학 및 FracLac 플러그인은 그림 6에 요약을 사용 하 여 프로토콜 단계. 우리 모두 손상 되지 않은 (그림 6A)에이 분석을 설명 하 고 부상 (그림 6B) 조직. 이진, 윤곽선, 볼록 선체/캡슐화 원과 상자 계산 예 각 셀으로 분석 하 고 프로토콜 없이 응용 프로그램은 그림 6 c-f. 에 표시 됩니다의 대표 이미지 이러한 이미지 그림 6G에 요약 되어 있는 형태 데이터에 있는 다름의 유래를 설명 하는 데 도움이.
그림 1입니다. 단일 기원 소마 (최적의)와 해당된 셀과 원래 photomicrograph 사이 해당 오버레이 대 원형 소마 (차선)와 해당된 microglia의 일러스트. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 형광 photomicrographs 응용 프로그램 프로토콜. 단일 셀 형광 photomicrograph에 적용 하는 해골 분석 프로토콜의 삽화는 세부 정보 표시를 잘립니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 밝은 분야 DAB 응용 프로그램 프로토콜 photomicrographs. 세부 정보 표시를 자른 단일 셀으로 밝은 분야 명인 photomicrograph에 적용 하는 해골 분석 프로토콜의 삽화. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 데이터 분석 프로토콜 응용 프로그램 없이. (A) 형광 IHC와 노란색 상자 (B)에 해당 하는 자른된 세포의 예를 들어 photomicrograph. 예를 들어 이진 및 해당 이미지 (C) (D) 설명 된 대로 적용 하는 프로토콜 없이. Microglia 끝점/셀 및 프로세스 길이/셀의 요약 데이터 (흰색) 상승과 부상 (E) (회색) 대뇌 피 질의 조직 및 (F) 없이 프로토콜 적용. 스튜던트 t-검정 및 n을 사용 하 여 통계 분석 = 3, * * p < 0.01을 나타냅니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 응용 프로그램 프로토콜 사용자 차이. 사용자 1 및 사용자 2에 의해 이진과 해골 이미지는 원래 이미지와 프로토콜 변환의 예입니다. 두 이미지의 차이 색된 동그라미를 일치 하는 강조 표시 됩니다. 사용자 1 및 사용자 2에 의해 손상 되지 않은 및 손상 된 두뇌 지구에서 microglia 끝점/셀 및 프로세스 길이/셀 데이터의 요약 그래프. 통계 분석 ANOVA와 샘플 크기는 n = 3; p < 0.05 * *p < 0.01, * * *p < 0.001. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. 프랙탈 분석 프로토콜 응용 프로그램 없이. 손상 되지 않은 (A)와 해당 이진 (C), 및 개요 (D) 이미지를 적용 하는 프로토콜 없이 결과 부상된 (B) 피 microglia의 자른된 photomicrographs의 예입니다. 관련된 볼록 선체 (파란색)와 해당 개요 도형 (E) (핑크) 원형 바깥쪽 모양 밀도 계산, 비율, 및 순환 (G)에 사용 됩니다. 계산 방법 상자 (F), 설명 및 프랙탈 차원 (DB) 및 lacunarity (λ) 계산 (G)에 대 한 사용. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
Microglia 셀 가늘게 생리학과 병리학 그들의 마이크로-도메인 내에서 조정 하 고 미묘한7,14 에 심한 부상8형태학2 의 다양 한 범위를 표시 합니다. ImageJ 프로토콜의 사용 microglia 형태학 정량화 모든 실험실에 액세스할 수 있는 플랫폼으로 만들고 플러그인 오픈 소스 이미지 프로세싱 소프트웨어는. 설명된 프로토콜 이미지 처리 및이 소프트웨어를 사용 하 여 분석에 초점을 맞추고, 하는 동안 데이터 수집, 유효성 및 안정성의 일관성 우수한 IHC와 현미경 검사로 시작 합니다. 이 프로토콜 이진, 해골, 그리고 전체 photomicrographs 및 단일 셀의 개요 대표를 개선 하는 데 사용 하지만 가난한 IHC 염색의 자리를 차지할 수 없습니다 그리고 낮은 반면, 결과 현미경 흐리게, 또는 왜곡 이미지. 추가 고려로 해야 합니다 주의 microglia 형태를 번복할 수 변경 저장, 단면, 전에 동안 뇌 조직의 병합을 하지. 마지막으로, 각 실험에서 microglia 해야 될 몇 군데 같은 현미경으로 동일한 규모를 사용 하 여. 계측, 목표, 및 소프트웨어 현미경 비슷한 목표에도 불구 하 고 다른 크기의 photomicrographs 귀착되 고 세부 사항 뿐만 아니라 각 프레임 내에서 셀의 수 사이 다. 예를 들어 이미지 수집 Leica SPII에 40 X 목표를 사용 하 여 두 수 세포와 수집 Zeiss 880을 사용 하 여 보다 자세히 결과. 이것은 전체 프레임 보다는 단일 셀에서 수집 된 셀 분파 데이터에 대 한 특히 중요 한이 데이터 샘플링의 문제가 된다.
일반적으로, 해골 분석 전체 photomicrograph를 이용 하는 두 가지 이유로 단일 셀 프랙탈 분석을 선행 한다. photomicrograph에 있는 모든 셀의 결정 셀 분파는 급속 한 때 단일 셀 프랙탈 분석에 비해 시간이 요인 경우 심사 도구로 고려 될 수 있습니다. 또한, 골격 분석 하는 동안 파생 된 이진 이미지 프랙탈 분석을 위해 사용 됩니다. 일단 몇 군데, 사용자 영향을 소개 기초 분석 결과 영향을 미칠 수 있는 중요 한 단계 수가 있습니다. 사용자 간의 대부분 변수 프로토콜 단계 단계 4.2 (증가 이미지 밝기) 이며 (임계값 결정) 4.5 단계. 가능 하면, 밝기 (0-255 사이의 max 또는 min 슬라이더)를 증가 하는 최적의 수 결정 이며 모든 이미지와 사용자를 위해 일정 하 게 유지. 이미지 변화는 훌륭한, 사용자 대신 밝기는 이미지 사이 선택할 수 있습니다. 또는, 이미지는 밝고 콘트라스트가 높은 경우 생략 될 수 있습니다 다음 밝기를 증가 하 고 임계 처리 전문 임계값 필터를 사용 하 여 표준화 될 수 있다 (예., 황) 보다는 더 많은 변수 기본. 일단 최적화, 추가 사용자 영향을 최소화 하기 위해 매개 변수를 준수 해야 됩니다.
사용자 가변성의 예는 그림 5에 표시 됩니다. 따라서 다양성 증가 사용자 1과 사용자 2 모두 데이터 컬렉션에 기여 하는 경우와 데이터 값 사용자 1과 사용자 2 대 증가 했다. 사용자 1 및 사용자 2 바이너리 및 해당 이미지의 차이의 예를 들어 컬러 서클 (그림 5)에 의해 강조 표시 됩니다. 이 경우, 두 사용자가 microglia에 제한 된 전문성을 갖춘 짧게 훈련된 학부 학생 이었다. 정기적인 감독과 microglia 증가 프로토콜 교육2 함께 전문가 의해 멘토링 간 사용자 가변성을 줄일 수 있습니다. 비록 여기 평가 하지, 프랙탈 분석이 작습니다 간 사용자 변화에 따라 이진은 수동으로 하 고 개별적으로 고립 된 임계 처리 microglia 모양 결정에 전적으로 의존 하는 것 보다는 한 photomicrograph 이기 때문에. 그러나, 모든 방법을 사용자 간의 몇 가지 변화를 보유합니다. 따라서, 단일 사용자 (이상적으로, 일부 전문 microglia 셀에 의해 훈련)는 전체 데이터 집합에 대 한 데이터 수집을 완료 해야 합니다.
추가 수정이이 프로토콜을 쉽게 만들 수 있습니다 하 고 이미지 품질과 노이즈를 줄이고 과정 연결을 보장 하는 노력에 따라 달라 집니다. 예를 들어 대비 충분 한 경우에, 언샵 마스크 필요 하지 않습니다 그리고 생략 될 수 있습니다. 그것은 최적화 하 고 이미지, 실험 사례 및 전체 집합에서 데이터를 수집 하는 전에 컨트롤의 특정 집합에 대 한 프로토콜을 마무리 하. 마지막으로, 추가 플러그인 사용할 수 있습니다 다른 장소를 명확히 하거나 이전에이 프로토콜에서 설명 되지 않은 이미지를 선명 하 게와 같은 팽창 또는 선명 하 게.
이 프로토콜의 이점은 그것의 보편적인 가용성 및 적응성 이다. 또한, 신속 하 고 전체 photomicrograph에 적용은 AnalyzeSkeleton를 사용 하 여 셀 분파를 평가입니다. 다중 셀 분석 방법의 이점은 전체 지역 보다는 단일 셀에 초점 이다. 따라서, 신속 하 게 이미지 내의 모든 microglia의 조건 (끝점 및 프로세스 길이) 평균 분파를 평가 가능 하다. 여러 셀의 분석을 제공 하는 뼈대 분석: 프랙탈 분석 photomicrographs에서 단일 셀을 필요한 시간 투자 때문에 의해 일치할 수 없는 셀 숫자의 측면에서 데이터 샘플링. 이 보일 수 있는 가장 적합 한 인스턴스 microglia 형태학 근거리 초점 부상에서 상영 될 것입니다. 한 제한은 전체 필드 이미지 렌더링 IHC photomicrographs의 뼈대 모델을 만들 때 더 많은 시간이 소요 단일 셀 방식에 비해 완벽 하지 않습니다. 또한, 지역 분석 적합 하지 않다 상황에 크게 동일한 필드 내 다른 microglia 형태학이 있다. 마지막으로,이 분석 방법은 세포 수, 실험 조건 간에 다를 수 매개 변수에 따라 달라 집니다.
프랙탈 분석 단일 셀에 진행 되며 따라서 뼈대 분석에서 결과 평균 셀 분파 데이터 출력을 보완 한다. 하지만 훨씬 더 많은 시간을 소모 하 고,이 투자 형태학 데이터의 광범위 한 범위를 생성 합니다. 예를 들어 세포 밀도, 스팬 비율, 그리고 순환 데이터 크기, 연신 율, 및 셀 개요의 모양을 각각 설명. 프랙탈 차원 및 lacunarity 요약 셀 복잡성과 모양이, 각각. 각 매개 변수를 계산 하는 방법 및 데이터 해석 될 수 있습니다 방법의 자세한 요약 대화형 수동16 에서 제공 되 고 같은 세부 구체적인 연구 질문에 관하여 고려 되어야 한다. 척도 생리 및 pathologic 조건에서 발생할 수 있는 2D microglia 형태학에 작은 변화를 중요 한 도구에 설명 된 프로토콜 결과. 견고, 볼록함이, 폼 팩터16,20 등 추가 형태학 분석 가능한 3D 도형을 생성 하는 경우 있을 수 있습니다.
프로토콜 개발 및 적응은 지속적이 고 사용자 중심. 그것은 소량/밝은-필드 이미지7 하지만 아직 임베디드 조직 파라핀 형광8 에서 확장 되었습니다. 그것은 또한, 추가 분석에 대 한 Imaris 등 독점 소프트웨어와 함께에서 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 생리학의 다양 한에 적용 될 수 microglia에 국한 되지 않습니다 하지만 어떤 셀 또는 특정 패턴 또는 IHC 메서드를 사용 하 여 식별 될 수 있는 조직에 적용 될 수 있습니다. 마지막으로, 충분 한 샘플 크기, 복수 또는 클러스터 분석에 적용할 수 있는 형태12,21;에 따르면 microglia 충 이것은 의미 있는 정보 microglia 형태학은 microglia 기능 및 그들의 주위에 응답의 중요 한 지표 이다입니다. Microglial 형태 론 적 다양성에 대 한 감사는 확장 하 고 완전히 건강 및 질병 명과 혈관 신경 상호 작용을 이해 하는 것이 중요. 이 분야에 있는 성장 계량 microglia 형태학 여러 연속 변수를 사용 하 여 요약을 개발, 사용 하기 쉬운, 그리고 재현성 프로토콜에 의해 향상 됩니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 NINR (F32NR013611)에서 재정 지원을 받았다. 우리는 더 인정 하 고 AnalyzeSkeleton(2D/3D) 및 FracLac의 개발자 감사 합니다 하 고 싶습니다 (알 간다 카레라스 외. , Karperien 그 외 여러분, 각각)는 여기에 설명 된 분석 되지 않을 것 이라고 수 없이.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
| Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
| Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
| 4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |
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