Karaktärisera DNA reparationsprocesser vid övergående och långvarig dubbel-strand DNA raster med hjälp av immunofluorescens mikroskopi
Summary
Reparation av dubbel-strand DNA raster är en dynamisk process som kräver inte bara bildandet av reparation komplex på rasterna, men också deras upplösning efter lesionen är riktat. Här, använder vi immunofluorescens mikroskopi för övergående och långvarig dubbelsträngat pauser som ett verktyg för att dissekera denna genomet underhåll mekanism.
Abstract
Reparation av dubbelsträngat raster (DSBs) i DNA är en starkt samordnad process, vilket nödvändiggör den bildande och upplösning av flera protein reparation komplex. Denna process regleras av en myriad av proteiner som främjar föreningen och disassociation av proteiner till dessa lesioner. Tack till stor del på förmågan att utföra funktionella skärmar av ett stort bibliotek med proteiner, det finns en större uppskattning av generna som behövs för dubbel-strand DNA paus reparation. Ofta knockout eller kemiska hämmare skärmar identifiera proteiner involverade i reparationsprocesser med ökad toxicitet som markör för ett protein som krävs för DSB reparation. Även användbar för identifierande roman cellulära proteiner involverade i att bibehålla genomet trohet, kräver funktionell analys vid fastställandet av huruvida proteinet av intresse främjar lokalisering, bildande eller upplösning av reparation komplex.
Ansamling av reparation proteiner kan upptäckas lätt som distinkta nukleära foci av immunofluorescens mikroskopi. Således, association och disassociation av dessa proteiner på platser i DNA-skador kan nås genom att observera dessa kärnvapen foci representativa mellanrum efter induktion av dubbel-strand DNA raster. Detta synsätt kan också identifiera mis lokaliserade reparation faktor proteiner, om reparera defekter inte förekommer samtidigt med ofullständig förseningar i reparation. I det här fallet kan långvarig dubbel-strand DNA raster vara konstruerad genom att uttrycka en sällsynt skärande Amiiiiin (t.ex., jag-SceI) i celler där webbplatsen erkännande för nämnda enzymet har integrerats i det cellulära genomet. Den resulterande lesionen är särskilt svårt att lösa som trogen reparation kommer att återinföra enzymets erkännande webbplats, föranledde ytterligare en runda av klyvning. Därmed elimineras skillnader i kinetik för reparation. Om reparation komplex inte bildas, har lokalisering hindrats. Det här protokollet beskriver metoden som är nödvändiga för att identifiera ändringar i reparation kinetik samt reparation protein lokalisering.
Introduction
Varje dag, varje cell i människokroppen bombarderas med en uppskattad 10,000 DNA lesioner1. Denna existentiella hot placerar oss i riskzonen för mutationer, Onkogenes samt cell death. För att skydda genomet trohet, har däggdjursceller utvecklats för att svara på DNA-skador med en komplex serie av protein föreningar och ändringar. Detta svar är uppdelad i flera vägar, kollektivt kallas DNA skador svar (DDR)2,3. DDR består av ansamling av DNA reparation proteiner vid DNA lesioner, samordnas både tidsmässigt och rumsligt. DDR inducerar ofta cellcykelarrest att undvika förökning eller intensifiering av skador som kan uppstå vid replikering av skadade DNA2,4,5. I sin tur, är det också nödvändigt för cellernas livskraft att stänga av cellcykelarrest genom frikoppla reparation komplex efter reparation har slutförts.
Bland de olika typerna av DNA-skador är DSBs den mest skadliga. Att reparera DSBs kan leda kromosom omflyttningar eller storskaliga borttagningar såsom förlust av hela kromosomen vapen. Reparation av DSBs är uppdelad i två vägar6,7,8. Homolog rekombination (HR) kräver en syster kromosom att använda som en DNA mall och därmed begränsas till sena S och G2/M faser av cellcykeln9,10. Icke-homolog slutet att gå (NHEJ) har inte dessa begränsningar men kan orsaka små borttagningar vid reparation DSBs11,12.
DSB reparerar specifikt och DDR är i allmänhet aktiva områden för utredning. Trots att vara organiserade i bekvämt åtskilda vägar, finns det en hel del redundans. Faktiskt, många proteiner (BRCA1, BRCA2 och den komplexa till exempel RPA) är involverade i flera vägar13,14,15,16. Reparation av en lesion av en väg, kan leda till en mellanliggande skada som måste repareras av en annan väg14. Sammanflätning av dessa vägar, kombinerat med deras komplexa uppgiften att rekrytera rätt proteinerna till rätt plats för den exakta mängden tid som behövs, kräver en flerskiktade regleringsprocess.
En färsk rapport belyser krångligheter av DDR av visar att reparera komplexa bildande, upplösning och lokalisering kan varje separat vara nedsatt17. Det övergripande målet för följande protokoll är att slutgiltigt dissekera cellernas förmåga att reparera DSB. Med hjälp av immunofluorescens mikroskopi, kan ansamling av reparation proteiner på platser av skador visualiseras på representativa punkter efter induktion av DSBs.
Denna teknik har flera fördelar med att vanliga metoder. Reparation är ofta undersökta enda tidpunkter och oförmögna att representera den dynamiska processen för församlingen och dissociation av reparation komplex. Att observera hela skalan av reparation från den första aktiveringen till full upplösning garanterar att reparationer fördröjs inte är felidentifierad som komplett hämning. Däremot garanterar det att induktion av reparation svar som inte kan inaktivera nämnda svar inte är felidentifierad som normal eller överdriven aktivering.
Fördröjd protein komplex bildandet och mis localizationen av reparation proteiner, dock kan inte entydigt skiljas med detta synsätt. För att avgöra om reparation proteiner är mis lokaliserade kontra fördröjd i deras localization, kan en ”long-lasting” DSB införas genom enzymatisk klyvning av cellulära DNA. Den resulterande lesionen är recut varje gång det repareras, vilket resulterar i en distinkt stora nukleära reparation fokus och ta bort den tidsmässiga begränsningen från rekrytering. Detta kan uppnås genom att ändra den befintliga metoden med användning av en sällsynt skärande Amiiiiin (t.ex., jag-SceI) att inducera en långvarig DSB. Livslängden av DSBs möjliggör visualisering av svårfångade reparation proteiner genom immunofluorescens mikroskopi. Det förbättra överflödet skulle också kunna förbättra visualisering när detektion hindras av begränsning i antikropp kvalitet, en funktion som kan vara användbar när mindre studerade proteiner är identifierade som inverkar på DNA-reparation.
Särskilt, ge vi explicita instruktioner för en gratis bild bearbetning och analys programvara (t.ex., ImageJ). Detta tar bort ett betydande ekonomiskt hinder i bildanalys, ingående förhör av DNA skada reparation till en bredare publik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analys av DNA skada reparation i allmänhet och reparation av dubbelsträngat DNA raster är specifikt ett aktivt område av forskning eftersom dess konsekvenser span uppkomst till grundläggande biologi6,20. Detta manuskript Detaljer ett förhållningssätt som exakt dissekerar bidrag av RAD51 och γ-H2AX proteiner till resolution av DSBs genom HR. ser fram, denna metod kan användas för att belysa ytterligare funktioner för reparation proteiner DSBs<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Joel Sanneman och Dr Philine Wangemann Confocal Microscopy kärna, finansierat av den Kansas State University College av Veterinary Medicin, för deras stöd för arbetet med att utveckla denna teknik. pCBASceI var en gåva från Maria Jasin (Addgene plasmid # 26477) 30. U2OS DR-GFP celler var en slags gåva från Maria Jasin18.
Materials
| 12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D’Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D’Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases–from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
