新しい脳領域の若いニューロンに挑戦と、神経細胞の運命と成熟の環境の sculpts に重要な洞察を明らかにできます。このプロトコルを記述する特定の脳領域からの介在ニューロン前駆体を収穫し、それらのいずれかの homotopically を移植する手順や出生後の子犬の脳にあり。
神経細胞の運命決定と成熟には、遺伝的プログラムや環境の信号間の複雑な相互作用が必要です。しかし、この分化過程を規制する外因性のメカニズムと組み込みのロールを disentangling はすべて発達にかの難問です。この問題は、gaba 作動性介在ニューロン、一時的な萌芽期の構造から生まれた、終脳全体を分散させるため長引く渡り鳥先行き非常に異種細胞集団の拡大です。どのように別の脳環境影響介在ニューロン運命と成熟を探索するには、新生児マウス (P0 P2) で特定の脳領域からの蛍光に分類された未熟な介在ニューロン前駆体を収穫するためのプロトコルを開発しました。この歳で、介在ニューロンの移行がほぼ完了してこれらの細胞は比較的小さなシナプス統合の最終的な休息環境に居住しています。フローサイトメトリーによって単一のセル、ソリューションのコレクション、次のこれらの介在ニューロン前駆体は P0 P2 野生型産後子犬に移植しました。両方つながれたを実行することによって (例えば、皮質-皮質) または異所性 (例えば、野-海馬) 移植、1 つの缶が彼らの運命, 成熟, および回路の集積の影響新しい脳環境で未熟な介在に挑戦を評価。脳が成体マウスの収穫できアッセイはさまざまな移植細胞の免疫組織化学的, を含む posthoc 分析、電気生理学的および転写プロファイリングします。この一般的なアプローチは、どのように異なる脳環境を分析するための戦略を持つ研究者がニューロンの開発の多くの側面に影響を与えるし、特定の神経細胞の特性、主にハードワイ ヤード遺伝プログラムによって駆動されている場合を識別または環境の手がかり。
適切な皮質機能は、興奮性の投射ニューロンと介在ニューロン gaba 作動性抑制性、明瞭な形態、電気生理学的特性、接続性と非常に異質人口のバランスを必要とする神経マーカー。異常な開発および介在ニューロン (および特定の介在サブグループ) の機能は、統合失調症、自閉症、てんかん1,2,3などの精神疾患の病態にリンクされています。さらに、これらの脳障害に関与する多くの遺伝子を若い介在4で濃縮され強く。したがって、通常の開発と多くの脳疾患の潜在的な病因を理解する介在ニューロンの運命決定と成熟を調節するメカニズムの理解が必要です。
2 一時的な萌芽期の構造、内側と仙骨神経節隆起から主に前脳のニューロンが生まれて (MGE と CGE、それぞれ)。これらの後の細胞 (介在ニューロン前駆体) さまざまな回路に組み込まれ、終脳全体で分散する長引く接線方向の移動相を受けます。MGE 派生介在ニューロンから成る 3 主重複、神経に定義されたサブグループ: 高速パルブアルブミン (PV+) 介在ニューロン、高速ソマトスタチン (SST+) 介在ニューロンのスパイクをスパイクと後期神経スパイク硝酸neurogliaform とアイビーの海馬の細胞を構成する酸化物合成酵素 (nNOS+) の介在。多数の研究所が太陽光発電+または SST + 介在ニューロン、モルフォゲン、介在ニューロン前駆体の生年月日および神経因性部モードの空間勾配を含む初期の運命の決定を調整する、MGE 内のいくつかのメカニズムを識別しました。5,6,7,8,9,10. 介在ニューロンが当初 ‘基本クラス’ に区別して徐々 に成熟して ‘決定的なクラス’11彼らの環境と対話することが提案されています。最近の証拠いくつかの成熟した介在のサブタイプことを示して遺伝子ハードワイ ヤードこれらの細胞は、神経節隆起の後になると初期定義された固有の遺伝的プログラムが以前よりも大きな役割を果たすことを示す感謝12,13。ただし、固有の遺伝的プログラムは、異なる介在サブタイプにドライブ分化する環境手がかりと対話する方法の重要な問題は大部分は未踏。
数多くの研究が様々 な成熟した細胞を移植し、一般的にローカルの内因性回路14,15を抑制する GABA をリリース コンセンサス結果による脳領域に直接 MGE の萌芽期細胞を移植します。 16,17,18,19。ひと誘導多能性幹細胞 (こと) を使用して大きな関心を生成している観測を約束これらの様々 な脳の病気を治療するために介在を派生します。ただし、これらの研究のいくつかの非常には、これらの移植細胞成熟成熟したニューロンの型にかを評価するときに、1 つの重要なコンポーネントは、トランスレーショナル アプローチについて考えています。
環境がどのように介在ニューロン分化と成熟に影響を与えるに対処するため接木介在ニューロンは、ホストの機能を採用するかどうかを調べるために新しい脳環境に未熟な介在ニューロン前駆体を移植して戦略を考案環境またはドナー環境20から機能を保持します。MGE の移植は、MGE は介在および多数の脳領域21全体分散 gaba 作動性投射細胞の混合された人口を含んでいるのでこの質問に対処するため適していません。これらの MGE の細胞は移行が知らなくても、1 つない完全に評価できますこれらの移植、脳環境によってどのように影響を受けるのか。移行を完了し、自分の目標に達している未熟な細胞を取得して初期産後縦長で介在ニューロン前駆体を収穫してこの問題を回避の頭脳領域しますが、最小限の操作環境で。大脳皮質の異なる領域間発現ニューロンの特定の機能に焦点を当て、その後、ホスト環境が介在プロパティを変更する方法を決定できます。このプロトコルで説明する一般的なアプローチは、任意の捜査に適用されるべき新しい環境で挑戦したときを動作することをどのように若いニューロンを検討したいです。
このプロトコルの 1 つの重要な側面は、細胞の生存を最大にします。組織や細胞が確実常に氷冷 carboxygenated sACSF では、細胞の生存を促進するために必要です。効率的な解離と解離細胞脳環境の内外で様々 なソリューションを過ごす時間の長さを最小限に抑える戦略が必要です。脳解剖され、移植の数、に応じて実験の長さを減少する郭清および/または移植の手順で支援パートナーに有益な?…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、健康の国民の協会 (K99MH104595) および T.J.P. に発育研究所所内研究プログラムに支えられました。 そのラボでこのアプローチは創業 Gord Fishell に感謝いたします。
Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
Glucose | Sigma | G7528 | |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
Pronase | Sigma | 10165921001 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
DNase I | Sigma | 4716728001 | |
Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |